【摘要】：研究背景及意義慢性淋巴細胞白血病是淋巴細胞克隆性增殖,浸潤骨髓、外周血、淋巴結(jié)、肝脾及其他器官,最終導(dǎo)致正常造血功能衰竭的一種腫瘤性疾病。該病是歐美國家最常見的成人血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來,隨著對慢性淋巴細胞白血病的分子生物學(xué)研究不斷深入,其診斷率逐年提高,目前,該病仍被認為是不可治愈的腫瘤性疾病,其具體的發(fā)病機制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),多條信號通路相互交叉,構(gòu)成體內(nèi)復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò),調(diào)控胚胎發(fā)育及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,因此,對于信號通路間交互作用的研究逐漸成為腫瘤治療的前沿領(lǐng)域。已有研究證實EGFR、Notch、Hedgehog等信號通路均可與Wnt相互交叉共同參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖和分化,如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肝癌等實體腫瘤中都可觀察到上述信號通路的表達失調(diào)。對于Hedgehog信號通路的研究已較為深入,Hedgehog通過PTCH和Smo發(fā)揮作用。正常情況下,PTCH與Smo結(jié)合處于失活狀態(tài)。當Hedgehog通路激活后,Hh配體與PTCH結(jié)合并內(nèi)吞,激活的Smo與Gli結(jié)合,促使Gli蛋白進入核內(nèi)持續(xù)性激活,啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄。Wnt信號通路主要通過3種途徑進行傳導(dǎo),最主要的是經(jīng)典Wnt信號途徑,及Wnt/β-catenin信號通路,這條信號通路激活后將募集細胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin轉(zhuǎn)移入細胞核并啟動靶基因轉(zhuǎn)錄,如c-myc、cyclinD1、COX-2、MMP等,因此,β-catenin的異常集聚及細胞核內(nèi)定位是經(jīng)典Wnt通路激活的重要標志,該信號通路的過度激活在惡性腫瘤的生長、增殖、轉(zhuǎn)移中均有重要意義。研究證實,多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與該通路的異常激活相關(guān),尤其是上皮來源的惡性腫瘤,如肺癌、乳腺癌、膽囊癌等。在脊椎動物和非脊椎動物中,Wnt和Hedgehog信號通路的功能性拮抗也已得到證實。研究發(fā)現(xiàn),Wnt和Hedgehog信號通路在視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細胞的增殖及兩棲動物肢體再生中起相反作用。Hedgehog激活SFRP-1抑制β-catenin在細胞核內(nèi)的集聚,從而抑制Wnt通路的活化。相反,β-catenin的異常集聚增強Gli3的活性,從而負反饋的抑制Hedgehog通路的過度激活。證實兩者在信號傳導(dǎo)過程中相互抑制,維持胚胎細胞增殖和分化過程的平衡。另外,Wnt信號通路可能作為Hedgehog的下游信號通路,在胃癌及宮頸癌患者中亦發(fā)現(xiàn)如上"串話"機制。最近的研究顯示,Hedgehog通路阻滯劑有多種,如Cyclopamine、GANT-58及GANT-61等,其中GANT-61直接作用于Hedgehog通路的轉(zhuǎn)錄因子Gli1/2,特異性地阻滯Gli1/2介導(dǎo)的靶基因激活,從而抑制腫瘤細胞的增殖與分化。對信號通路交叉作用的研究能夠更全面的揭示信號通路在腫瘤中的重要作用,克服單一信號通路研究的局限性,為惡性腫瘤的研究和治療提供新的方向和靶點。為進一步探討Hedgehog與Wnt信號通路的拮抗作用與慢性淋巴細胞白血病的關(guān)系,我們主要進行一下兩方面的研究:①檢測Hedgehog與Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3在慢性淋巴細胞白血病患者中的表達情況,并進行預(yù)后相關(guān)性研究②對CLL細胞株MEC-1用不同濃度的GANT-61處理,檢測處理前后細胞存活率及Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3的蛋白表達差異,探討Hedgehog與Wnt信號通路的拮抗作用。第一部分Hedgehog與Wnt信號通路在慢性淋巴細胞白血病發(fā)病機制及預(yù)后中的相關(guān)性研究目的:檢測Hedgehog與Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3在慢性淋巴細胞白血病患者中的表達情況,探討其與患者臨床數(shù)據(jù)指標及預(yù)后的相關(guān)性。方法:收集自2010年12月21日至2015年10月31日在山東省立醫(yī)院血液科住院治療的CLL患者骨髓或外周血標本共43例,正常人外周血標本10例作為正常對照組。應(yīng)用western blot檢測Gli1、β-catenin、SFRP-1、Gli3的蛋白表達水平。采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,患者臨床病理資料與Gli1、β-catenin、SFRP-1、Gli3的蛋白表達水平采用Spearman相關(guān)分析,應(yīng)用COX多因素回歸模型進行預(yù)后因素分析,采用Kaplan-Meier法對患者進行生存分析,應(yīng)用Logrank檢驗比較生存差別,從而探討Hedgehog與Wnt信號通路的異常激活與慢性淋巴細胞白血病發(fā)病機制及預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果:CLL患者中Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3的表達水平均明顯高于正常對照組(P0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,證實在慢性淋巴細胞白血病患者中,Hedgehog及Wnt信號通路均為異常激活。應(yīng)用COX多因素回歸模型分析,Gli1、β-catenin、年齡、Rai臨床分期、Benit臨床分期與患者生存顯著相關(guān)(P0.05),性別、LDH水平、β2微球蛋白、白細胞計數(shù)、B癥狀、SFRP-1、Gli3與生存率無明顯相關(guān)性(P0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,Gli1及β-catenin高表達的患者預(yù)后較差(P0.05),SFRP-1、Gli3高表達的患者與預(yù)后無明顯相關(guān)性(P0.05)。結(jié)論:Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3 高表達提示 Hedgehog 與 Wnt 信號通路在慢性淋巴細白血病發(fā)病中具有重要意義,另外,Gli3的高表達提示W(wǎng)nt信號通路的異�；罨赡芗せ盍� Hedgehog通路的負反饋抑制作用,抑制Hedgehog通路的進一步活化。Gli1及β-catenin高表達與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。第二部分Hedgehog抑制Wnt信號通路對慢性淋巴細胞白血病細胞株(MEC-1)增殖活性的影響目的:①檢測Hedgehog與Wnt信號通路的關(guān)鍵蛋白Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3在慢性淋巴細胞白血病細胞株(MEC-1)中的表達情況,探討兩條信號通路的激活在CLL細胞株中的表達情況。②對CLL細胞株MEC-1用不同濃度的GANT-61處理,檢測處理前后細胞存活率及Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3的蛋白表達情況,探討Hedgehog與Wnt信號通路的拮抗作用。方法:應(yīng)用 western blot 檢測 MEC-1 中 Gli1、β-catenin、SFRP1、Gli3 的表達情況,探討Hedgehog與Wnt信號通路在CLL細胞株中的表達情況。加入不同濃度的Gli1/2抑制劑GANT-61,采用CCK-8法檢測不同劑量(10-150umol/L)、不同作用時間(24-72小時)對MEC-1的增殖抑制作用,應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測細胞存活率。對比處理前后Gli1、β-catenin、SFRP1、Gli3的蛋白表達水平差異,初步探討hedgehog抑制Wnt信號通路對MEC-1的增殖作用。結(jié)果:CLL細胞株中Gli1、β-catenin、SFRP-1、Gli3表達明顯高于正常對照組(P0.05),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,證實Hedgehog及Wnt信號通路的異常激活在CLL細胞株MEC-1中的重要作用。GANT-61干預(yù)實驗證實,GANT-61對MEC-1的增殖抑制作用具有時間-濃度依賴關(guān)系。Gli1的表達量在藥物濃度50umol/L,作用時間24h時明顯降低(P＜0.05)。SFRP1的表達量在濃度50umol/L,作用時間24h時明顯降低(P0.05)。β-catenin的表達量在濃度50umol/L,作用時間24h時較前升高(P0.05)。Gli3的表達量在濃度50umol/L,作用時間24h時無明顯變化(P0.05);增加藥物濃度(100umol/L),不延長作用時間,不引起Gli3表達量的明顯改變(P0.05);延長作用時間(48h)可引起Gli3表達量的進一步升高(P0.05)。結(jié)論:Gli1、SFRP-1、β-catenin、GH3 的高表達提示 Hedgehog 與 Wnt 信號通路在CLL細胞株(MEC-1)中的重要作用。Hedgehog作為Wnt信號通路的上游通路,通過抑制Wnt信號通路促進CLL細胞株MEC-1的增殖。GANT-61對MEC-1的增殖抑制作用具有時間-濃度依賴關(guān)系。另外,GANT-61抑制Hedgehog信號通路,通過上調(diào)β-catenin的表達,增強可Gli3的活性,提示W(wǎng)nt信號通路的異常活化可能激活了 Hedgehog通路的負反饋抑制作用,抑制Hedgehog通路的進一步活化,提示兩條信號通路間的"串話"機制。
[Abstract]:This disease is one of the most common malignant tumors in the adult blood system . In recent years , the study has shown that the signaling pathways of EGFR , Notch , Hedgehog and other signaling pathways can be used to regulate the proliferation and differentiation of tumor cells . In order to investigate the effects of Hedgehog and Wnt signaling pathway on the expression of Gli1 , SFRP - 1 , 尾 - catenin and Gli3 in the pathogenesis and prognosis of chronic lymphocytic leukemia . The expression of Gli1 , SFRP - 1 , 尾 - catenin and Gli3 in chronic lymphocytic leukemia cell line ( MEC - 1 ) was significantly correlated with the expression of Gli1 , SFRP - 1 , 尾 - catenin and Gli3 . The expression of Gli1 , 尾 - catenin , SFRP - 1 , Gli3 in the cell line MEC - 1 was significantly higher than that in the normal control group ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.72

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本文編號：2135200