【摘要】：研究背景及意義慢性淋巴細(xì)胞白血病是淋巴細(xì)胞克隆性增殖,浸潤骨髓、外周血、淋巴結(jié)、肝脾及其他器官,最終導(dǎo)致正常造血功能衰竭的一種腫瘤性疾病。該病是歐美國家最常見的成人血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來,隨著對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病的分子生物學(xué)研究不斷深入,其診斷率逐年提高,目前,該病仍被認(rèn)為是不可治愈的腫瘤性疾病,其具體的發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn),多條信號(hào)通路相互交叉,構(gòu)成體內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò),調(diào)控胚胎發(fā)育及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,因此,對(duì)于信號(hào)通路間交互作用的研究逐漸成為腫瘤治療的前沿領(lǐng)域。已有研究證實(shí)EGFR、Notch、Hedgehog等信號(hào)通路均可與Wnt相互交叉共同參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和分化,如肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和肝癌等實(shí)體腫瘤中都可觀察到上述信號(hào)通路的表達(dá)失調(diào)。對(duì)于Hedgehog信號(hào)通路的研究已較為深入,Hedgehog通過PTCH和Smo發(fā)揮作用。正常情況下,PTCH與Smo結(jié)合處于失活狀態(tài)。當(dāng)Hedgehog通路激活后,Hh配體與PTCH結(jié)合并內(nèi)吞,激活的Smo與Gli結(jié)合,促使Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)持續(xù)性激活,啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄。Wnt信號(hào)通路主要通過3種途徑進(jìn)行傳導(dǎo),最主要的是經(jīng)典Wnt信號(hào)途徑,及Wnt/β-catenin信號(hào)通路,這條信號(hào)通路激活后將募集細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核并啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄,如c-myc、cyclinD1、COX-2、MMP等,因此,β-catenin的異常集聚及細(xì)胞核內(nèi)定位是經(jīng)典Wnt通路激活的重要標(biāo)志,該信號(hào)通路的過度激活在惡性腫瘤的生長、增殖、轉(zhuǎn)移中均有重要意義。研究證實(shí),多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與該通路的異常激活相關(guān),尤其是上皮來源的惡性腫瘤,如肺癌、乳腺癌、膽囊癌等。在脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物中,Wnt和Hedgehog信號(hào)通路的功能性拮抗也已得到證實(shí)。研究發(fā)現(xiàn),Wnt和Hedgehog信號(hào)通路在視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖及兩棲動(dòng)物肢體再生中起相反作用。Hedgehog激活SFRP-1抑制β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的集聚,從而抑制Wnt通路的活化。相反,β-catenin的異常集聚增強(qiáng)Gli3的活性,從而負(fù)反饋的抑制Hedgehog通路的過度激活。證實(shí)兩者在信號(hào)傳導(dǎo)過程中相互抑制,維持胚胎細(xì)胞增殖和分化過程的平衡。另外,Wnt信號(hào)通路可能作為Hedgehog的下游信號(hào)通路,在胃癌及宮頸癌患者中亦發(fā)現(xiàn)如上"串話"機(jī)制。最近的研究顯示,Hedgehog通路阻滯劑有多種,如Cyclopamine、GANT-58及GANT-61等,其中GANT-61直接作用于Hedgehog通路的轉(zhuǎn)錄因子Gli1/2,特異性地阻滯Gli1/2介導(dǎo)的靶基因激活,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與分化。對(duì)信號(hào)通路交叉作用的研究能夠更全面的揭示信號(hào)通路在腫瘤中的重要作用,克服單一信號(hào)通路研究的局限性,為惡性腫瘤的研究和治療提供新的方向和靶點(diǎn)。為進(jìn)一步探討Hedgehog與Wnt信號(hào)通路的拮抗作用與慢性淋巴細(xì)胞白血病的關(guān)系,我們主要進(jìn)行一下兩方面的研究:①檢測(cè)Hedgehog與Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中的表達(dá)情況,并進(jìn)行預(yù)后相關(guān)性研究②對(duì)CLL細(xì)胞株MEC-1用不同濃度的GANT-61處理,檢測(cè)處理前后細(xì)胞存活率及Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3的蛋白表達(dá)差異,探討Hedgehog與Wnt信號(hào)通路的拮抗作用。第一部分Hedgehog與Wnt信號(hào)通路在慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制及預(yù)后中的相關(guān)性研究目的:檢測(cè)Hedgehog與Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中的表達(dá)情況,探討其與患者臨床數(shù)據(jù)指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性。方法:收集自2010年12月21日至2015年10月31日在山東省立醫(yī)院血液科住院治療的CLL患者骨髓或外周血標(biāo)本共43例,正常人外周血標(biāo)本10例作為正常對(duì)照組。應(yīng)用western blot檢測(cè)Gli1、β-catenin、SFRP-1、Gli3的蛋白表達(dá)水平。采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,患者臨床病理資料與Gli1、β-catenin、SFRP-1、Gli3的蛋白表達(dá)水平采用Spearman相關(guān)分析,應(yīng)用COX多因素回歸模型進(jìn)行預(yù)后因素分析,采用Kaplan-Meier法對(duì)患者進(jìn)行生存分析,應(yīng)用Logrank檢驗(yàn)比較生存差別,從而探討Hedgehog與Wnt信號(hào)通路的異常激活與慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制及預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果:CLL患者中Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3的表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證實(shí)在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中,Hedgehog及Wnt信號(hào)通路均為異常激活。應(yīng)用COX多因素回歸模型分析,Gli1、β-catenin、年齡、Rai臨床分期、Benit臨床分期與患者生存顯著相關(guān)(P0.05),性別、LDH水平、β2微球蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、B癥狀、SFRP-1、Gli3與生存率無明顯相關(guān)性(P0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,Gli1及β-catenin高表達(dá)的患者預(yù)后較差(P0.05),SFRP-1、Gli3高表達(dá)的患者與預(yù)后無明顯相關(guān)性(P0.05)。結(jié)論:Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3 高表達(dá)提示 Hedgehog 與 Wnt 信號(hào)通路在慢性淋巴細(xì)白血病發(fā)病中具有重要意義,另外,Gli3的高表達(dá)提示W(wǎng)nt信號(hào)通路的異�；罨赡芗せ盍� Hedgehog通路的負(fù)反饋抑制作用,抑制Hedgehog通路的進(jìn)一步活化。Gli1及β-catenin高表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。第二部分Hedgehog抑制Wnt信號(hào)通路對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株(MEC-1)增殖活性的影響目的:①檢測(cè)Hedgehog與Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株(MEC-1)中的表達(dá)情況,探討兩條信號(hào)通路的激活在CLL細(xì)胞株中的表達(dá)情況。②對(duì)CLL細(xì)胞株MEC-1用不同濃度的GANT-61處理,檢測(cè)處理前后細(xì)胞存活率及Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3的蛋白表達(dá)情況,探討Hedgehog與Wnt信號(hào)通路的拮抗作用。方法:應(yīng)用 western blot 檢測(cè) MEC-1 中 Gli1、β-catenin、SFRP1、Gli3 的表達(dá)情況,探討Hedgehog與Wnt信號(hào)通路在CLL細(xì)胞株中的表達(dá)情況。加入不同濃度的Gli1/2抑制劑GANT-61,采用CCK-8法檢測(cè)不同劑量(10-150umol/L)、不同作用時(shí)間(24-72小時(shí))對(duì)MEC-1的增殖抑制作用,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞存活率。對(duì)比處理前后Gli1、β-catenin、SFRP1、Gli3的蛋白表達(dá)水平差異,初步探討hedgehog抑制Wnt信號(hào)通路對(duì)MEC-1的增殖作用。結(jié)果:CLL細(xì)胞株中Gli1、β-catenin、SFRP-1、Gli3表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證實(shí)Hedgehog及Wnt信號(hào)通路的異常激活在CLL細(xì)胞株MEC-1中的重要作用。GANT-61干預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí),GANT-61對(duì)MEC-1的增殖抑制作用具有時(shí)間-濃度依賴關(guān)系。Gli1的表達(dá)量在藥物濃度50umol/L,作用時(shí)間24h時(shí)明顯降低(P＜0.05)。SFRP1的表達(dá)量在濃度50umol/L,作用時(shí)間24h時(shí)明顯降低(P0.05)。β-catenin的表達(dá)量在濃度50umol/L,作用時(shí)間24h時(shí)較前升高(P0.05)。Gli3的表達(dá)量在濃度50umol/L,作用時(shí)間24h時(shí)無明顯變化(P0.05);增加藥物濃度(100umol/L),不延長作用時(shí)間,不引起Gli3表達(dá)量的明顯改變(P0.05);延長作用時(shí)間(48h)可引起Gli3表達(dá)量的進(jìn)一步升高(P0.05)。結(jié)論:Gli1、SFRP-1、β-catenin、GH3 的高表達(dá)提示 Hedgehog 與 Wnt 信號(hào)通路在CLL細(xì)胞株(MEC-1)中的重要作用。Hedgehog作為Wnt信號(hào)通路的上游通路,通過抑制Wnt信號(hào)通路促進(jìn)CLL細(xì)胞株MEC-1的增殖。GANT-61對(duì)MEC-1的增殖抑制作用具有時(shí)間-濃度依賴關(guān)系。另外,GANT-61抑制Hedgehog信號(hào)通路,通過上調(diào)β-catenin的表達(dá),增強(qiáng)可Gli3的活性,提示W(wǎng)nt信號(hào)通路的異�；罨赡芗せ盍� Hedgehog通路的負(fù)反饋抑制作用,抑制Hedgehog通路的進(jìn)一步活化,提示兩條信號(hào)通路間的"串話"機(jī)制。
[Abstract]:This disease is one of the most common malignant tumors in the adult blood system . In recent years , the study has shown that the signaling pathways of EGFR , Notch , Hedgehog and other signaling pathways can be used to regulate the proliferation and differentiation of tumor cells . In order to investigate the effects of Hedgehog and Wnt signaling pathway on the expression of Gli1 , SFRP - 1 , 尾 - catenin and Gli3 in the pathogenesis and prognosis of chronic lymphocytic leukemia . The expression of Gli1 , SFRP - 1 , 尾 - catenin and Gli3 in chronic lymphocytic leukemia cell line ( MEC - 1 ) was significantly correlated with the expression of Gli1 , SFRP - 1 , 尾 - catenin and Gli3 . The expression of Gli1 , 尾 - catenin , SFRP - 1 , Gli3 in the cell line MEC - 1 was significantly higher than that in the normal control group ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.72

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本文編號(hào)：2135200