【摘要】：研究目的肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范圍內(nèi)第五大常見癌癥,其致死率居第三位,全球每年約50萬人死于HCC。其主要致病因素是乙型及丙型肝炎病毒感染,此外長期酗酒、黃曲霉素感染、脂肪肝等因素也會導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。HCC發(fā)生與進(jìn)展的分子機(jī)制目前尚未完全闡明,因此對其進(jìn)行深入探索將為從分子水平對肝癌進(jìn)行早期預(yù)防和干預(yù)奠定基礎(chǔ)。AIM2(Absent in melanoma 2)是干擾素誘導(dǎo)的HIN-200蛋白家族中的一員,其作為一種胞內(nèi)DNA感受器,在固有免疫中發(fā)揮重要作用,近年來的研究顯示,AIM2也能夠影響腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。AIM2對肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展是否發(fā)揮效應(yīng)及其作用機(jī)制目前尚不明確。本課題深入研究了AIM2在對肝細(xì)胞肝癌進(jìn)展過程中的作用效應(yīng),并初步探討了其分子機(jī)制。該研究證實(shí)AIM2表達(dá)缺失通過激活mTOR-S6K1信號通路促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展,為肝細(xì)胞肝癌的分子靶向治療提供了新思路。材料和方法1.肝細(xì)胞肝癌組織及其配對非癌肝組織中AIM2表達(dá)情況監(jiān)測1.1免疫組化染色應(yīng)用49例肝癌及其對應(yīng)的遠(yuǎn)端非癌肝組織的石蠟切片,對AIM2分子進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,檢測其在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)定位與表達(dá)水平。1.2 Western blot檢測應(yīng)用Western blot的方法檢測64例肝癌患者的肝癌組織及其配對非癌肝組織中AIM2蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)用Image J軟件對肝癌組織及其對應(yīng)的非癌肝組織中AIM2表達(dá)條帶進(jìn)行定量分析,并應(yīng)用Graph Pad Prism5.0軟件對條帶灰度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.3 Real-time PCR檢測應(yīng)用Real-time PCR檢測64例肝癌組織及其配對非癌肝組織中AIM2 mRNA的表達(dá)水平,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2.AIM2對肝癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響2.1肝癌細(xì)胞系的篩選應(yīng)用Western blot的方法檢測HepG2、HUH7、BEL7402、SMCC7721、 MHCC97H和MHCC97L六種肝癌細(xì)胞系中AIM2的相對表達(dá)量。2.2 AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建向SMCC7721和HUH7肝癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染AIM2表達(dá)質(zhì)粒,并以空白載體轉(zhuǎn)染組作為對照,轉(zhuǎn)染24h后,應(yīng)用Western blot的方法在蛋白水平驗(yàn)證AIM2是否高表達(dá),以此判定AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建是否成功。2.3檢測過表達(dá)AIM2對肝癌細(xì)胞增殖,克隆形成和遷移侵襲能力的影響在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)的細(xì)胞模型中,應(yīng)用CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測AIM2過表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。2.4 AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型的構(gòu)建2.4.1 AIM2特異性Si-RNA的篩選向肝癌細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染合成的三條靶向AIM2的小干擾RNA(Si-AIM2),并以非特異性無義序列(Si-NC)轉(zhuǎn)染組作為對照,篩選出兩條干擾效率達(dá)80%以上的Si-AIM2,,用于構(gòu)建AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型。2.4.2 AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型的構(gòu)建向BEL7420和HepG2肝癌細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染Si-AIM2以干擾AIM2的表達(dá),并以Si-NC轉(zhuǎn)染組作為對照。應(yīng)用Western blot在蛋白水平驗(yàn)證是否有效干擾AIM2的表達(dá),以此判定AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型是否構(gòu)建成功。2.5 AIM2表達(dá)受抑制對肝癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響在成功構(gòu)建的AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,通過CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測干擾AIM2表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響；通過Transwell實(shí)驗(yàn),檢測干擾AIM2表達(dá)對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。3.AIM2炎癥小體激活的相關(guān)檢測3.1在AIM2過表達(dá)的細(xì)胞模型和AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中檢測AIM2依賴性炎癥小體是否活化分別在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)和表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,應(yīng)用Westernblot檢測炎癥小體活化后下游效應(yīng)分子Caspase-1和IL-β的剪切,以此來判斷AIM2炎癥小體的形成與活化。3.2檢測AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型中IL-1β以及Caspase-1的剪切在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)的細(xì)胞模型中,應(yīng)用ELISA分別在0h,12h,24h,36h和48h檢測IL-1β的剪切；在上述時間點(diǎn),應(yīng)用Caspase-1底物剪切試劑盒檢測Caspase-1的剪切。3.3 AIM2依賴性炎癥小體激活后的細(xì)胞焦亡檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放實(shí)驗(yàn)是用于檢測炎癥小體活化后發(fā)生細(xì)胞焦亡的經(jīng)典方法。在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型中,應(yīng)用LDH釋放實(shí)驗(yàn)分別在0h,24h,36h和48h檢測乳酸脫氫酶的釋放量,進(jìn)一步確定細(xì)胞是否發(fā)生炎癥小體激活后的細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)。4.AIM2對肝癌細(xì)胞作用效應(yīng)的機(jī)制研究4.1 AIM2過表達(dá)的細(xì)胞模型中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的篩選在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)的細(xì)胞模型中,Western blot檢測AIM2過表達(dá)后mTOR、AKT、NF-KappaB等信號通路的變化,以篩選AIM2發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵信號通路。4.2 AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的篩選在成功構(gòu)建的AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,Western blot檢測AIM2過表達(dá)前后mTOR、AKT、NF-kappaB等信號通路的變化,以進(jìn)一步反向驗(yàn)證AIM2過表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。4.3驗(yàn)證AIM2是否通過抑制mTOR-S6K1信號通路對HCC發(fā)揮抑癌效應(yīng)在成功構(gòu)建的AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,抑制mTOR-S6K1信號通路的活化,應(yīng)用CCK-8、克隆形成以及Transwell等實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證mTOR-S6K1通路封閉以后,能否逆轉(zhuǎn)AIM2缺失對HCC的促進(jìn)效應(yīng)。5.構(gòu)建裸鼠異種移植瘤模型,驗(yàn)證AIM2對HCC的抑癌效應(yīng)5.1裸鼠異種移植瘤模型的構(gòu)建肝癌細(xì)胞系BEL7402和SMCC7721(1×107)皮下接種于裸鼠(雄性,4-6周)左腋內(nèi)側(cè),待出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤后,開始在瘤內(nèi)注射30ugAIM2質(zhì)粒,同時在對照組瘤內(nèi)注射30ug空載體,隔天注射一次。注射25天后,處死小鼠,分離腫瘤,驗(yàn)證AIM2對肝細(xì)胞肝癌的作用效應(yīng)。5.2驗(yàn)證腫瘤內(nèi)AIM2是否成功過表達(dá)將剝離出的腫瘤組織提取RNA和蛋白質(zhì),應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢驗(yàn)?zāi)[瘤組織內(nèi)是否成功過表達(dá)AIM2。5.3比較實(shí)驗(yàn)組與對照組中腫瘤的體積、重量將剝離的腫瘤組織稱取重量,量取腫瘤體積,比較分析實(shí)驗(yàn)組和對照組之間腫瘤的體積和重量差異。5.4在腫瘤組織中進(jìn)一步驗(yàn)證信號通路用Western blot檢測mTOR信號通路中相關(guān)分子的磷酸化水平的變化,以驗(yàn)證細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究結(jié)果1.與非癌肝組織相比,AIM2在肝癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)1.1免疫組化結(jié)果顯示,AIM2在HCC組織中的表達(dá)顯著下調(diào)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,AIM2在肝癌組織中的染色強(qiáng)度明顯降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AIM2與性別、年齡、腫瘤大小等指標(biāo)之間不相關(guān),但與病理分級、臨床分期之間呈顯著性負(fù)相關(guān)(**P0.01)。以上結(jié)果提示,AIM2在HCC的表達(dá)量顯著降低,其缺失表達(dá)可能促進(jìn)HCC疾病的惡性進(jìn)展。1.2 Real-time PCR結(jié)果顯示,AIM2 mRNA在HCC的表達(dá)量顯著下調(diào)應(yīng)用Real-time PCR的方法對64例肝癌患者中肝癌組織及對應(yīng)的遠(yuǎn)端非癌肝組織中的AIM2 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,與非癌肝組織相比,肝癌組織中AIM2在mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)(*P0.05)。1.3 Western blot結(jié)果顯示,AIM2的蛋白水平在HCC的表達(dá)量顯著下調(diào)應(yīng)用Western blot對64例肝癌患者中肝癌組織及對應(yīng)的遠(yuǎn)端非癌肝組織中AIM2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,與非癌肝組織相比,肝癌組織中AIM2蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)(**P0.01)。1.4 AIM2蛋白的表達(dá)缺失可促進(jìn)HCC的惡性進(jìn)展Western blot的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,AIM2的表達(dá)與性別、年齡等指標(biāo)無顯著性相關(guān)關(guān)系,但與腫瘤大小、臨床分期以及是否發(fā)生轉(zhuǎn)移之間呈顯著性負(fù)相關(guān)(*P0.05,*P0.05,P**0.01)。2.AIM2抑制肝癌細(xì)胞的增殖、克隆形成以及侵襲能力2.1肝癌細(xì)胞系的篩選Western blot結(jié)果顯示,SMCC7721和HUH7肝癌細(xì)胞系中AIM2的相對表達(dá)量較高,用于構(gòu)建AIM2過表達(dá)的細(xì)胞模型；BEL7402和HepG2肝癌細(xì)胞系中AIM2的表達(dá)量相對較高,用于構(gòu)建AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型。2.2 AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型中,肝癌細(xì)胞的惡性行為受到抑制與空載體轉(zhuǎn)染組相比,AIM2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的肝癌細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力均顯著降低；同時,其遷移、侵襲能力顯著降低。2.3 AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,肝癌細(xì)胞的惡性行為顯著增強(qiáng)在成功構(gòu)建的AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,與Si-NC轉(zhuǎn)染組相比,Si-AIM2轉(zhuǎn)染組的肝癌細(xì)胞的增殖能力、克隆形成能力和侵襲能力均顯著提高。3.AIM2通過促進(jìn)炎癥小體的形成誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡AIM2作為DNA感受器,可以通過結(jié)合ASC以及Caspase-1而形成AIM2-ASC-Caspase-1炎癥小體,通過誘導(dǎo)形成焦亡小體,使細(xì)胞發(fā)生焦亡。3.1 AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型中,AIM2依賴性炎癥小體被激活在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型中,與空載體轉(zhuǎn)染組相比,AIM2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中Pro-Caspase-1和Pro-IL-1p的剪切均顯著上調(diào),提示AIM2依賴性炎癥小體的形成和活化。3.2 AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,AIM2依賴性炎癥小體受到抑制在AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,Pro-Caspase-1和Pro-IL-1β的剪切均顯著下調(diào),提示AIM2依賴性炎癥小體受到抑制。3.3 AIM2炎癥小體對Pro-Caspase-1和Pro-IL-1p的剪切存在時間依賴性在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型中,Caspase-1底物檢測實(shí)驗(yàn)和IL-1pELISA實(shí)驗(yàn)表明,Caspase-1和IL-1p的能夠發(fā)生時間依賴性的剪切和活化。3.4 AIM2依賴性炎癥小體激活后引起細(xì)胞焦亡在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型中,LDH釋放實(shí)驗(yàn)表明,AIM2轉(zhuǎn)染組中LDH的釋放量顯著增多,提示AIM2的過表達(dá)能夠促進(jìn)炎癥小體的形成,并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡。3.5炎癥小體抑制劑能夠有效抑制AIM2的抑癌效應(yīng)在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)的細(xì)胞模型中,加入炎癥小體抑制劑,抑制炎癥小體的形成,AIM2對肝癌細(xì)胞抑癌效應(yīng)被有效逆轉(zhuǎn)。4.AIM2通過抑制mTOR-S6K1信號通路抑制肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展4.1 AIM2抑制mTOR-S6K1信號通路的活化在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)的細(xì)胞模型中,Western blot檢測結(jié)果顯示,包括p-mTOR,p-S6K1,p-S6以及p-4E-BP1等mTOR-S6K1信號通路分子的磷酸化水平均顯著降低；而在AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,mTOR-S6K1信號通路分子的磷酸化水平顯著降低。以上結(jié)果提示,AIM2能夠有效抑制mTOR-S6K1信號通路的活化。4.2 AIM2抑制HIF-1a表達(dá)HIF-1a是mTOR-S6K1信號通路的下游分子,我們進(jìn)一步檢測了AIM2對HIF-1a的影響。在AIM2過表達(dá)細(xì)胞模型中,Western blot檢測到低氧誘導(dǎo)因子1-a (HIF-1a)的表達(dá)水平也顯著降低。而在AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,HIF-1a的表達(dá)水平顯著升高。4.3 AIM2通過炎癥小體依賴的方式抑制mTOR-S6K1信號通路的活化在成功構(gòu)建的AIM2過表達(dá)的細(xì)胞模型中,加入炎癥小體抑制劑。在炎癥小體被有效抑制后,mTOR信號通路的相關(guān)分子p-S6,p-4E-BP1的磷酸化水平顯著提高,提示,AIM2抑制mTOR-S6K1的作用被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果說明,AIM2以炎癥小體依賴性方式抑制mTOR-S6K1通路的活化。4.4 AIM2通過抑制mTOR-S6K1信號通路的活化對HCC發(fā)揮抑癌效應(yīng)在AIM2表達(dá)受抑制的細(xì)胞模型中,加入mTOR通路的抑制劑后,肝癌細(xì)胞的惡性行為被有效逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果均提示,AIM2通過抑制mTOR-S6K1信號通路的活化抑制肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展。5.AIM2有效抑制裸鼠異種移植瘤的生長裸鼠成瘤模型構(gòu)建成功后,瘤內(nèi)注射AIM2表達(dá)質(zhì)粒,并以空載體注射組作為對照。注射25天后處死小鼠,分離腫瘤。結(jié)果顯示,AIM2注射組的腫瘤體積、大小和重量均顯著低于對照組。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,AIM2注射組中mTOR-S6K1信號通路蛋白磷酸化水平顯著降低。以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證,AIM2通過抑制mTOR-S6K1信號通路對HCC發(fā)揮抑癌效應(yīng)。結(jié)論1.肝癌組織中AIM2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著下調(diào),并與肝癌的病理分級和臨床分期呈顯著性負(fù)相關(guān)。2.AIM2能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力,從而抑制其惡性行為。3.AIM2通過誘導(dǎo)炎癥小體的形成抑制mTOR-S6K1信號通路的活化,從而抑制肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展。創(chuàng)新點(diǎn)及意義1.本課題首次發(fā)現(xiàn),AIM2在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)下調(diào)和缺失促進(jìn)了肝癌的進(jìn)展。2.本課題首次報道了AIM2分子對mTOR-S6K1調(diào)控效應(yīng)。3.本課題首次提出AIM2通過形成炎癥小體,抑制mTOR-S6K1信號通路的活化,從而發(fā)揮對肝細(xì)胞肝癌的抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：2131672