本文選題：色氨酸 + 犬尿氨酸　； 參考：《南京大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：L-色氨酸是人體體內(nèi)不能合成的8種必需氨基酸之一,在體內(nèi)代謝途徑包括由色氨酸羥基化酶(tryptophan hydroxylase)等介導(dǎo)的芳香環(huán)羥基化反應(yīng),是合成褪黑素和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的重要途徑;而由吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)介導(dǎo)的降解途徑,是合成煙酸/維生素B3等生理物質(zhì)的重要途徑。色氨酸攝入不足或者色氨酸代謝異�？梢詫�(dǎo)致嬰幼兒發(fā)育遲緩以及精神抑郁等。色氨酸代謝主要發(fā)生在小腸和中樞神經(jīng)系統(tǒng),但是在腫瘤細(xì)胞中異�；钴S,與某些腫瘤的發(fā)生以及腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)。色氨酸在腫瘤細(xì)胞中主要通過(guò)IDO降解,其降解產(chǎn)物之一犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)不但可以抑制樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)功能,還可以與芳香族化合物受體(aryl hydrocarbon receptor,AHR)結(jié)合,激活A(yù)HR通路,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。臨床試驗(yàn)證明,選擇性抑制IDO具有明顯治療作用。本研究建立了以Kyn-AHR為評(píng)價(jià)系統(tǒng)的小分子化合物篩選體系,以腦膠質(zhì)瘤模型評(píng)價(jià)了這類(lèi)化合物的抗腫瘤活性以及作用機(jī)制。首先,我們利用最新的基因敲除技術(shù)CRISPR/Cas9建立了 AHR基因缺陷的腦膠質(zhì)瘤穩(wěn)定細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)AHR缺失的細(xì)胞系與野生型細(xì)胞系相比生長(zhǎng)速度減慢,并且腫瘤集落形成能力顯著降低。AHR作為細(xì)胞內(nèi)一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子,與配體結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,我們發(fā)現(xiàn)AHR基因敲除后不僅能夠顯著抑制其下游基因CYP1B1的表達(dá),同時(shí)還可以降低其他促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的炎癥因子的水平如IL-8和IL-6等。在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,AHR敲除后不僅能夠降低細(xì)胞本身炎癥因子mRNA的表達(dá)并且能夠顯著減少TNF-α誘導(dǎo)的炎癥因子的表達(dá)。通過(guò)建立小鼠的皮下腫瘤模型,我們進(jìn)一步確認(rèn)了 AHR敲除細(xì)胞系在體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)能力顯著低于野生型細(xì)胞系�；谇贸鼳HR基因可以顯著降低腫瘤的生長(zhǎng)能力,我們利用熒光素酶報(bào)告基因方法篩選出了兩個(gè)能夠抑制Kyn-AHR通路的小分子化合物,并利用免疫印跡技術(shù)對(duì)其抑制活性進(jìn)行了驗(yàn)證。腫瘤集落形成實(shí)驗(yàn)證明候選化合物能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),而利用核磁共振成像技術(shù)顯示小分子化合物抑制AHR活性可以在體內(nèi)顯著抑制腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)以及提高小鼠的生存率。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),小分子化合物主要通過(guò)抑制AHR的入核來(lái)抑制AHR的功能從而發(fā)揮抗腫瘤活性。綜上所述,我們利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)證明了抑制AHR的功能可以抑制腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。通過(guò)建立體外篩選模型,從天然產(chǎn)物和合成的小分子化合物中篩選出犬尿氨酸激活A(yù)HR通路的抑制劑,利用生物化學(xué)方法和小鼠動(dòng)物模型系統(tǒng)證明了這些抑制劑具有抗腦膠質(zhì)瘤作用,并進(jìn)一步闡明小分子化合物抑制色氨酸代謝和抗膠質(zhì)瘤作用的分子機(jī)理,探討抑制Kyn-AHR信號(hào)通路作為抗腦膠質(zhì)瘤治療方案的可能性,有望發(fā)現(xiàn)新的候選藥物靶點(diǎn)分子。
[Abstract]:L-tryptophan is one of the eight essential amino acids that cannot be synthesized in human body. The metabolic pathways in vivo include aromatic cyclohydroxylation mediated by tryptophan hydroxylase (tryptophan hydroxylase) and so on. It is an important way to synthesize melatonin and 5-hydroxytryptamine, and the degradation pathway mediated by indoleamine-2o 3-dioxygenase (IDO) is an important pathway for the synthesis of physiological substances such as nicotinic acid / vitamin B3. Inadequate tryptophan intake or abnormal tryptophan metabolism can lead to stunting and depression in infants and young children. Tryptophan metabolism mainly occurs in the small intestine and central nervous system, but it is very active in tumor cells, which is closely related to the occurrence of some tumors and tumor immune escape. Tryptophan is mainly degraded by IDO in tumor cells. Kynurenine kyn, one of the degradation products of tryptophan, can not only inhibit the function of dendritic cells (dendritic cells), but also bind to (aryl hydrocarbon receptor AHR, and activate the AHR pathway. Thus promoting the growth and migration of tumor cells. Clinical trials have proved that selective inhibition of IDO has obvious therapeutic effect. In this study, a screening system of small molecular compounds with Kyn-AHR as evaluation system was established, and the antitumor activity and mechanism of these compounds were evaluated by glioma model. First of all, we used the latest gene knockout technique CRISPR-Cas9 to establish a stable glioma cell line with AHR gene deficiency. We found that the AHR deficient cell line was slower than the wild-type cell line. The ability of tumor colony formation was significantly reduced. AHR, as an important transcriptional factor in cells, entered the nucleus to perform transcriptional regulation after binding with ligands. We found that the knockout of AHR gene not only inhibited the expression of CYP1B1, but also decreased the levels of other inflammatory factors such as IL-8 and IL-6. AHR knockout in glioma cells not only decreased the expression of inflammatory factor mRNA but also significantly reduced the expression of TNF- 偽 -induced inflammatory factor in glioma cells. By establishing a subcutaneous tumor model in mice, we further confirmed that the tumor growth ability of AHR knockout cell line was significantly lower than that of wild-type cell line in vivo. Based on the fact that knockout of AHR gene can significantly reduce tumor growth ability, two small molecular compounds which can inhibit Kyn-AHR pathway were screened by luciferase reporter gene method, and their inhibitory activity was verified by Western blotting. The tumor colony formation assay showed that the candidate compounds could inhibit the growth of tumor cells. Magnetic resonance imaging showed that the inhibition of AHR activity by small molecular compounds could significantly inhibit the growth of gliomas and improve the survival rate of mice in vivo. Further studies have shown that small molecular compounds inhibit the function of AHR by inhibiting the nucleation of AHR and thus play an important role in antitumor activity. In conclusion, we use CRISPRR / Cas9 gene knockout technique to prove that inhibiting the function of AHR can inhibit the growth of glioma. An in vitro screening model was established to screen out the inhibitors of canine uric acid activating the AHR pathway from natural products and synthetic small molecular compounds. The biochemistry method and mouse animal model system showed that these inhibitors had anti-glioma effect, and further elucidated the molecular mechanism of the inhibition of tryptophan metabolism and anti-glioma action by small molecular compounds. To explore the possibility of inhibiting Kyn-AHR signaling pathway as an antiglioma therapy, we hope to find new candidate drug target molecules.
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R73-36

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