本文選題：鼻咽癌 + 放射增敏��； 參考：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:鼻咽癌是來(lái)源于鼻咽部黏膜上皮的一種惡性腫瘤,根據(jù)世界衛(wèi)生組織分型標(biāo)準(zhǔn),可分為角化型和非角化型鱗癌、分化型非角化癌、未分化癌。我國(guó)是鼻咽癌的高發(fā)國(guó)家之一,南方的發(fā)病率又高于北方,且以未分化癌為主。放射治療是鼻咽癌的主要治療方式,臨床療效良好,但仍有部分患者會(huì)產(chǎn)生放療抵抗,再次放療效果不佳。FANCD2基因是范科尼貧血家族中的一員,該家族基因參與了DNA損傷修復(fù),構(gòu)成范科尼貧血通路,FANCD2在該通路中起核心作用。項(xiàng)目組在前期研究中,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)鼻咽癌患者FANCD2蛋白表達(dá)量增高,推測(cè)其參與了鼻咽癌放療抵抗。在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)了解沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)對(duì)放療前后細(xì)胞克隆形成、增殖、周期、凋亡等的影響,探索沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)提高鼻咽癌CNE-2細(xì)胞放療敏感性的可能性。方法:以鼻咽癌CNE-2細(xì)胞作為研究對(duì)象,采用RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清,于37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為三組:未做任何干預(yù)的野生型CNE-2細(xì)胞;含有無(wú)效序列的對(duì)照組細(xì)胞CNE-2NC;含有sh RNA-FANCD2干擾序列的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞CNE-2sh。(1)構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株,用慢病毒感染CNE-2細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀(guān)察感染效率,嘌呤霉素進(jìn)行藥物篩選一周以上,至無(wú)新的死亡細(xì)胞為止,獲得沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株CNE-2sh和含有無(wú)效序列的對(duì)照組穩(wěn)定細(xì)胞株CNE-2NC。提取三組細(xì)胞中的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為c DNA,采用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FANCD2 m RNA的表達(dá)量;提取三組細(xì)胞的總蛋白,利用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FANCD2蛋白的表達(dá)量;(2)平板克隆實(shí)驗(yàn),將三組細(xì)胞CNE-2、CNE-2NC、CNE-2sh接種于6孔板,經(jīng)過(guò)0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy劑量放療,放療后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)7-14天,待細(xì)胞生長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)的直徑約0.1-0.3cm克隆后,終止培養(yǎng),使用多聚甲醛固定細(xì)胞,染色、漂洗,晾干后拍照、觀(guān)察、計(jì)數(shù)。在倒置顯微鏡下對(duì)每大于50個(gè)細(xì)胞的克隆進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算克隆形成率,使用多靶單擊模型和線(xiàn)性二次模型進(jìn)行擬合,得到存活分?jǐn)?shù),計(jì)算放療生物學(xué)相關(guān)參數(shù);(3)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),上述三組細(xì)胞接種于96孔板中,在經(jīng)過(guò)0Gy和6Gy劑量放療后繼續(xù)培養(yǎng),放療后第24、48、72、96小時(shí),在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)每個(gè)孔的光密度值,繪制出細(xì)胞增殖曲線(xiàn);(4)細(xì)胞凋亡檢測(cè),上述三組細(xì)胞接種于6孔板中,在經(jīng)過(guò)0Gy和6Gy劑量放療后繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí),終止培養(yǎng),按細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Annexin V-PE和7AAD染色后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;(5)細(xì)胞周期檢測(cè),上述三組細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中,在經(jīng)過(guò)0Gy和6Gy劑量放療后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),終止培養(yǎng),按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PI染色后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果:(1)沉默效率驗(yàn)證結(jié)果,熒光定量PCR結(jié)果顯示三組細(xì)胞FANCD2 m RNA的相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.035,P0.05),CNE-2sh組中FANCD2 m RNA表達(dá)量(0.254±0.072)顯著低于CNE-2組(1.000±0.000)和CNE-2NC組(0.690±0.078);Western Blot結(jié)果顯示三組細(xì)胞中的FANCD2蛋白相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2450.370,P0.05)。CNE-2sh組中FANCD2蛋白表達(dá)量(0.130±0.025)顯著低于CNE-2組(1.672±0.028)和CNE-2NC組(1.336±0.013),沉默效率為92.20%;(2)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果,未經(jīng)過(guò)放療(0Gy)時(shí)三組細(xì)胞之間克隆形成率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.600,P0.05);經(jīng)過(guò)放療(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy)后三組細(xì)胞之間的克隆形成率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)值分別為(F=49.132,P0.05)、(F=590.113,P0.05)、(F=286.798,P0.05)、(F=77.167,P0.05)、(F=27.000,P0.05),放療后CNE-2sh組的細(xì)胞克隆形成率顯著小于CNE-2組和CNE-2NC組;細(xì)胞存活曲線(xiàn)顯示CNE-2sh組的生存曲線(xiàn)較CNE-2組和CNE-2NC組下移,多靶單擊模型擬合得到放療增敏比=1.44,線(xiàn)性二次模型擬合得到放療增敏比=1.18,放療增敏比均1;(3)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果,未經(jīng)過(guò)放療(0Gy)的情況下,在0h、24h、48h時(shí)CNE-2sh組光密度值與CNE-2和CNE-2NC組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)值分別為(F=0.303,P0.05),(F=0.193,P0.05),(F=0.067,P0.05),在72h、96h時(shí),三組細(xì)胞的光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)值分別為(F=24.148,P0.05),(F=15.029,P0.05),CNE-2sh組的光密度值(0.342±0.018,0.671±0.045)顯著小于CNE-2組(0.453±0.019,0.900±0.017)和CNE-2NC組(0.411±0.022,0.825±0.075);經(jīng)過(guò)放療(6Gy)后0h、24h、48h的CNE-2sh組光密度值與CNE-2組和CNE-2NC組之間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)值分別為(F=0.172,P0.05)、(F=1.224,P0.05)、(F=0.444,P0.05),在72h、96h時(shí),三組間細(xì)胞光密度值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)值分別為(F=88.598,P0.05),(F=77.371,P0.05),CNE-2sh組光密度值(0.300±0.009,0.411±0.020)弱于CNE-2組(0.443±0.018,0.634±0.027)和CNE-2NC組(0.402±0.012,0.574±0.021);(4)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果,未經(jīng)過(guò)放療時(shí),三組細(xì)胞間的細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.218,P0.05),CNE-2sh組的細(xì)胞凋亡率(4.90±0.21)顯著高于CNE-2組(3.36±0.89)和CNE-2NC組(3.09±0.59);經(jīng)過(guò)放療(6Gy)后,三組細(xì)胞間的細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.872,P0.05),CNE-2sh組細(xì)胞凋亡率(19.05±1.99)顯著高于CNE-2組(11.26±0.85)和CNE-2NC組(11.08±1.17);(5)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,三組細(xì)胞在未經(jīng)過(guò)放療時(shí)細(xì)胞周期主要分布在G1期和S期,G2期細(xì)胞較少,三組細(xì)胞在G1期、S期、G2期的比例差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)值分別為(F=7.555,P0.05),(F=19.382,P0.05),(F=27.031,P0.05)。CNE-2sh組在G1期(38.54±1.29)、S期(41.06±1.24)的比例顯著大于CNE-2組(33.78±2.03)、(37.70±0.75)和CNE-2NC組(34.24±1.55)、(36.48±0.72),在G2期的比例(20.07±1.52)顯著少于CNE-2組(28.28±1.58)和CNE-2NC組(29.94±2.12);經(jīng)過(guò)放療后三組細(xì)胞的細(xì)胞周期分布發(fā)生改變,G1期、S期細(xì)胞減少,G2期細(xì)胞增加,在CNE-2sh與CNE-2和CNE-2NC三組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)值分別為(F=26.785,P0.05)、(F=10.571,P0.05)、(F=39.523,P0.05),CNE-2sh組在G1期(13.64±1.93)、S期(16.56±3.39)的比例顯著小于CNE-2組(21.37±1.19)、(24.72±1.53)和CNE-2NC組(21.66±1.35)、(22.86±1.32),在G2期的比例(66.60±0.74)顯著大于CNE-2組(53.91±2.70)和CNE-2NC組(55.47±1.75)。結(jié)論:(1)sh RNA干擾能夠獲得穩(wěn)定沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)的鼻咽癌CNE-2細(xì)胞(CNE-2sh),沉默效率達(dá)到預(yù)期;(2)沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)后能夠抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞放療后的克隆形成率;(3)通過(guò)多靶單擊模型和線(xiàn)性二次模型擬合后計(jì)算獲得放療增敏比1,提示沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)能夠提高鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的放療敏感性;(4)沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)后能夠顯著抑制鼻咽癌CNE-2細(xì)胞放療前、后的細(xì)胞增殖;(5)沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)后能夠顯著促進(jìn)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞放療前、后的細(xì)胞凋亡;(6)沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)后能夠顯著改變鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的細(xì)胞周期分布,放療后使阻滯在G2期的細(xì)胞顯著增多,提高了放療敏感性。(7)本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)sh RNA干擾沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)能夠提高鼻咽癌CNE-2細(xì)胞的放療敏感性,在此基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)沉默F(xiàn)ANCD2表達(dá)提高鼻咽癌CNE-2細(xì)胞放療敏感性進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和可能機(jī)制的研究,有望為提高鼻咽癌放療敏感性治療提供新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective : Nasopharyngeal carcinoma ( NPC ) is a kind of malignant tumor derived from nasopharyngeal mucosa epithelium . According to the WHO classification standard , it can be divided into two groups : angle - type and non - squamous cell carcinoma , differentiation - type non - squamous cell carcinoma and undifferentiated carcinoma . ( 1 ) To construct a stable cell line , to infect CNE - 2 cells with slow virus infection , to observe the efficiency of infection under the fluorescence microscope , to obtain the stable cell line CNE - 2sh and the control group stable cell line CNE - 2NC . Results : ( 1 ) Compared with CNE - 2 group ( F = 75.035 , P0.05 ) , the expression of FAN2 mRNA in CNE - 2sh group ( 0.254 鹵 0.072 ) was significantly lower than that of CNE - 2 group ( 0.000 鹵 0.000 ) and CNE - 2NC group ( 0.690 鹵 0.078 ) . The cell survival curves of CNE - 2sh group were significantly lower than that of CNE - 2 and CNE - 2NC groups ( F = 0.600 , P0.05 ) . There was no significant difference between CNE - 2group and CNE - 2NC group ( F = 7.218 , P 0.05 ) and CNE - 2NC group ( 0.411 鹵 0.019 , 0.641 鹵 0.021 ) and CNE - 2NC group ( 0.411 鹵 0.019 , 0.641 鹵 0.021 ) and CNE - 2NC group ( 0.411 鹵 0 . 01.019 , 0.641 鹵 0.021 ) . The apoptosis rate of CNE - 2sh group was significantly higher than that in CNE - 2NC group ( 3.36 鹵 0 . 089 ) and CNE - 2NC group ( 11.08 鹵 1.17 ) .
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 Kuang-Rong Wei;Rong-Shou Zheng;Si-Wei Zhang;Zhi-Heng Liang;Zhi-Xiong Ou;Wan-Qing Chen;;Nasopharyngeal carcinoma incidence and mortality in China in 2010[J];Chinese Journal of Cancer;2014年08期

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本文編號(hào)：2110674