本文選題：PAX基因 + 膠質(zhì)瘤細(xì)胞��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》2017年12期

【摘要】：目的構(gòu)建shRNA-PAX6慢病毒載體并觀察其對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響。方法根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的PAX6靶點(diǎn)序列,設(shè)計(jì)兩條PAX6基因的si RNA靶點(diǎn)干擾序列,引物退火形成帶粘性末端的雙鏈,與經(jīng)BamH I、EcoR I雙酶切后線性化的慢病毒載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化,構(gòu)建shRNA-PAX6慢病毒重組載體,再經(jīng)菌落PCR及測(cè)序鑒定重組載體;在293T細(xì)胞中包裝病毒,將包裝后的shRNA-PAX6慢病毒重組載體感染U251細(xì)胞。Real-time PCR檢測(cè)PAX6 mRNA的表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)PAX6蛋白的表達(dá),MTT法檢測(cè)U251細(xì)胞增殖。結(jié)果慢病毒載體p LKD-CMV-GNR-U6-shRNA經(jīng)雙酶切后可見(jiàn)線性化的8208 bp大片段,菌落PCR及測(cè)序鑒定證實(shí)shRNA-PAX6慢病毒重組載體構(gòu)建成功,構(gòu)建的shRNA-PAX6慢病毒載體在293T細(xì)胞完成包裝,測(cè)得慢病毒滴度為6.73×10~8TU/m L;Real-time PCR結(jié)果顯示,沉默PAX6的表達(dá)可見(jiàn)U251細(xì)胞PAX6 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組及慢病毒空載體組(P0.05);Western blot結(jié)果顯示,PAX6蛋白表達(dá)亦明顯低于正常對(duì)照組及慢病毒空載體組(P0.05);MTT結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組及慢病毒空載體組細(xì)胞比較,感染shRNA-PAX6慢病毒重組載體組的細(xì)胞,細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)(P0.05)。結(jié)論成功構(gòu)建人PAX6基因的shRNA-PAX6慢病毒重組載體,沉默PAX6基因的表達(dá),U251細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。
[Abstract]:Objective to construct shRNA-PAX6 lentivirus vector and to observe the effect of shRNA-PAX6 lentivirus vector on the proliferation of glioma U251 cells. Methods according to the PAX6 target sequence reported in the literature, two si RNA target interference sequences of PAX6 gene were designed. The primers were annealed to form double strands with sticky ends, and ligated with lentivirus vector linearized by BamH Irito Ecor I double enzyme. The recombinant vector of lentivirus shRNA-PAX6 was constructed, and the recombinant vector was identified by colony PCR and sequencing. The expression level of PAX6 mRNA was detected by real-time PCR in U251 cells infected with recombinant shRNA-PAX6 lentivirus vector. The expression of PAX6 protein was detected by Western blot and the proliferation of U251 cells was detected by MTT assay. Results A linearized 8208 BP fragment of lentivirus vector pLKD-CMV-GNR-U6-shRNA was found after double enzyme digestion. Colony PCR and sequencing confirmed that the recombinant shRNA-PAX6 lentivirus vector was successfully constructed, and the constructed shRNA-PAX6 lentivirus vector was packaged in 293T cells. The titer of lentivirus was 6.73 脳 10 ~ (-8) TU / m ~ (real-time) PCR. The expression of PAX6 mRNA in U251 cells was significantly lower than that in normal control group and lentivirus empty vector group (P0.05). The results of Western blot showed that the expression of PAX6 protein in U251 cells was significantly lower than that in normal control group and lentivirus empty vector group (P0.05). Compared with the normal control group and the lentivirus empty vector group, the cells infected with shRNA-PAX6 lentivirus recombinant vector group, the cell proliferation ability was significantly increased (P0.05). Conclusion the recombinant vector of human PAX6 gene shRNA-PAX6 lentivirus was successfully constructed and the proliferation ability of U251 cells was enhanced by silencing the expression of PAX6 gene.
【作者單位】： 中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81472160) 湖南省自然科學(xué)基金(2015JJ2157)~~
【分類(lèi)號(hào)】：R739.41

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