本文選題：前列腺癌 + 去勢抵抗性前列腺癌��； 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：研究背景前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展與抑癌基因突變、DNA修復(fù)基因失活及原癌基因異常激活密切相關(guān),有多種信號通路參與�；虻倪x擇性剪接調(diào)控在前列腺癌中發(fā)揮重要作用,對于前列腺癌至關(guān)重要的雄激素受體(androgen receptor,AR)受剪接調(diào)控能夠產(chǎn)生多種異構(gòu)體,其中AR-V7和AR-V567es參與前列腺癌耐受內(nèi)分泌治療并進(jìn)展為去勢抵抗前列腺癌的過程。研究發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白KHDRBS1能夠協(xié)助剪接小體識別AR外顯子3b并完成剪接最終形成AR-V7,而且KHDRBS1異常促進(jìn)包括前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤進(jìn)展并與臨床分期、病理分級和患者預(yù)后等臨床指標(biāo)正相關(guān)。KHDRBS1基因有兩個同源且高度保守的亞家族成員,KHDRBS2和3,二者與KHDRBS1在RNA結(jié)合功能域KH域有70%～80%的氨基酸序列一致,并且與KHDRBS1存在交互作用,同時與乳腺癌、腎癌等也有關(guān)聯(lián)。但KHDRBS2和3在前列腺癌中的作用研究仍屬空白。本課題中我們對KHDRBS家族在PCa進(jìn)展中的作用,特別是KHDRBS2和3對前列腺癌細(xì)胞的作用以及與AR及AR剪接異構(gòu)體的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)探討,以增加對KHDRBS家族的認(rèn)識,豐富前列腺癌發(fā)生進(jìn)展的分子機制研究。研究目的1.明確KHDRBS家族基因在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平;2.明確KHDRBS2和3在前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及細(xì)胞周期中的作用;3.明確KHDRBS2和3間的相互關(guān)系;4.明確KHDRBS家族與AR、AR-V7和AR-V567es的關(guān)系。研究方法和結(jié)果一、KHDRBS家族在前列腺癌中的生物信息學(xué)分析及在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)驗證方法:1)應(yīng)用cBioPortal在線工具對來自于TCGA等11個研究計劃的前列腺癌樣本集合的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,總結(jié)KHDRBS家族基因在樣本集合中基因改變的比例、表達(dá)水平以及與總生存及無病生存期的關(guān)系;2)應(yīng)用Real-time PCR檢測前列腺癌細(xì)胞系22RV1、LnCap、DU145和PC3細(xì)胞mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:1)基于cBioPortal調(diào)用的11個樣本集合,與KHDRBS1相比,KHDRBS2和3在PCa樣本集合中的基因改變發(fā)生更為廣泛,并且KHDRBS3能夠影響樣本集合中患者的總生存,提示KHDRBS2和3可能與PCa發(fā)生發(fā)展相關(guān)。2)樣本均為去勢抵抗性前列腺癌及去勢抵抗性神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌的NEPC樣本集合中,KHDRBS1,2和3基因發(fā)生改變的樣本比例最高,提示KHDRBS家族可能與去勢抵抗性前列腺癌進(jìn)展有關(guān)。3)K KHDRBS1在22RV1、LnCap、DU145和PC3中均有表達(dá)。22RV1細(xì)胞中KHDRBS2高表達(dá),KHDRBS3低表達(dá);而PC3細(xì)胞中KHDRBS2低表達(dá),KHDRBS3高表達(dá)。提示二者的表達(dá)具有細(xì)胞類型特異性。二、KHDRBS2和3對前列腺癌細(xì)胞的作用方法:1)應(yīng)用瞬時轉(zhuǎn)染過表達(dá)及慢病毒轉(zhuǎn)染敲減改變KHDRBS2和3在22RV1和PC3細(xì)胞中的表達(dá)水平,并應(yīng)用Muse細(xì)胞儀、Transwell法及CCK-8法和體內(nèi)成瘤實驗分別檢測細(xì)胞的細(xì)胞周期、遷移、侵襲及體外和體內(nèi)的增殖能力。2)同前法改變KHDRBS2和3在22RV1和PC3細(xì)胞中的表達(dá)水平,應(yīng)用Real-time PCR及Western-Blot檢測對應(yīng)細(xì)胞中KHDRBS2和3的變化,明確KHDRBS2和3在前列腺癌細(xì)胞中的關(guān)系。結(jié)果:1)瞬時過表達(dá)能夠成功構(gòu)建高表達(dá)KHDRBS2和3的PC3和22RV1細(xì)胞模型;2)慢病毒轉(zhuǎn)染敲減KHDRBS2或3能夠成功構(gòu)建低表達(dá)KHDRBS2的22RV1或低表達(dá)KHDRBS3的PC3細(xì)胞模型;3)敲減KHDRBS2能夠抑制22RV1細(xì)胞的增殖能力,而敲減KHDRBS3能夠抑制PC3細(xì)胞的增殖能力;4)過表達(dá)或敲減KHDRBS2后KHDRBS3在mRNA和蛋白水平的表達(dá)發(fā)生降低或增高改變,而過表達(dá)或敲減KHDRBS3之后KHDRBS2的表達(dá)水平也發(fā)生降低或增高,但改變KHDRBS2或3的表達(dá)對KHDRBS 1的表達(dá)水平則無影響。三、KHDRBS家族與雄激素受體的關(guān)系方法:1)應(yīng)用 Real-time PCR 檢測 22RV1、LnCap、DU145 和 PC3 細(xì)胞 AR-FL、AR-V7和AR-V567es的表達(dá)水平。2)應(yīng)用Real-time PCR檢測有無雄激素及AR拮抗劑的條件下,22RV1細(xì)胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es及22RV1和PC3細(xì)胞中KHDRBS1,2和3的表達(dá)水平。3)應(yīng)用Real-time PCR檢測過表達(dá)KHDRBS2和3及敲減KHDRBS2的22RV1細(xì)胞AR-FL、AR-V7和AR-V567es的表達(dá)水平。4)在有無雄激素的條件下,應(yīng)用Real-time PCR檢測過表達(dá)KHDRBS2和3的22RV1細(xì)胞中KHDRBS2和3的mRNA表達(dá)變化以及敲減KHDRBS2的22RV1細(xì)胞中KHDRBS2、KHDRBS3、AR 和 AR-V7 的 mRNA 表達(dá)變化。結(jié)果:1)22RV1細(xì)胞中AR-FL、AR-V7和AR-V567es高表達(dá);而在PC3細(xì)胞中三種AR異構(gòu)體均低表達(dá)。2)無雄激素條件下22RV1細(xì)胞中AR、AR-V7和AR-V567es及KHDRBS1和2表達(dá)水平較正常培養(yǎng)組顯著升高,具有統(tǒng)計學(xué)意義,KHDRBS3雖有升高趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義;在PC3中,同樣處理對于KHDRBS家族基因的表達(dá)無影響;3)敲減KHDRBS2可顯著降低22RV1細(xì)胞中AR-V7的表達(dá)水平,P值為0.0168。4)過表達(dá)KHDRBS2和3以及敲減KHDRBS2的22RV1細(xì)胞,無論是否添加雄激素,KHDRBS2、KHDRBS3、AR和AR-V7的mRNA表達(dá)變化與未做過表達(dá)和敲減的22RV1細(xì)胞對雄激素的反應(yīng)一致。研究結(jié)論1.cBioPortal分析前列腺癌樣本提示KHDRBS2和3可能在前列腺癌及去勢抵抗性前列腺癌發(fā)生進(jìn)展中具有重要作用。2.在22RV1和PC3細(xì)胞,KHDRBS2和3的表達(dá)具有細(xì)胞類型特異性并與AR及其異構(gòu)體表達(dá)表現(xiàn)出相關(guān)性。3.分別敲減KHDRBS2或3能夠抑制22RV1或PC3細(xì)胞的增殖能力。4.在22RV1和PC3細(xì)胞中,KHDRBS2和3呈現(xiàn)交互調(diào)節(jié)的關(guān)系。5.去除雄激素導(dǎo)致的KHDRBS1和2表達(dá)上調(diào)可能是由AR-FL介導(dǎo)的。敲減KHDRBS2可以抑制22RV1細(xì)胞AR-V7的表達(dá)。KHDRBS1和2可能是AR-FL與AR-V7之間的調(diào)控因素。
[Abstract]:Background prostate cancer is a common malignant tumor in the male reproductive system. Its development is closely related to the mutation of the tumor suppressor gene, the inactivation of the DNA repair gene and the abnormal activation of the proto oncogene. There are a variety of signaling pathways involved. Androgen receptor (AR) is regulated by splicing and can produce a variety of isomers, in which AR-V7 and AR-V567es are involved in prostate cancer tolerance and endocrine therapy and are progressing to the process of prostatic cancer. The study found that RNA binding protein KHDRBS1 can assist splicing corpuscles to identify 3B in AR exons and complete the splicing and eventually form AR-V7, and K. HDRBS1 abnormalities promote the progression of a variety of malignant tumors, including prostate cancer, and clinical staging, pathological grading, and patient prognosis. The.KHDRBS1 gene has two homologous and highly conserved subfamily members, KHDRBS2 and 3, and two and KHDRBS1 are consistent with the amino acid sequences of 70% to 80% in the KH domain of RNA binding domain, and There is a interaction with KHDRBS1, which is also associated with breast and renal cancer. But the role of KHDRBS2 and 3 in prostate cancer is still a blank. In this subject, we discuss the role of the KHDRBS family in the progression of PCa, especially the role of KHDRBS2 and 3 on prostate cancer cells and the relationship between AR and AR splicing isomers. To increase the understanding of the KHDRBS family and to enrich the molecular mechanism of the progression of prostate cancer. Purpose 1. to clarify the expression level of the KHDRBS family in the prostate cancer cell lines; 2. to clarify the role of KHDRBS2 and 3 in the proliferation, migration, invasion and cell cycle of prostate cancer cells; 3. clear the relationship between KHDRBS2 and 3, and the correlation between the 3 and the KHDRBS2. The relationship between the KHDRBS family and the AR, AR-V7 and AR-V567es. Research methods and results 1. Bioinformatics analysis of the KHDRBS family in prostate cancer and the expression in the prostate cancer cell lines: 1) use the cBioPortal online tool to analyze the data of the collection of prostate cancer samples from the 11 research projects, such as TCGA. The ratio of gene change, expression level and relationship with total survival and disease-free survival in the collection of KHDRBS family genes; 2) detection of mRNA expression levels in prostate cancer cell lines 22RV1, LnCap, DU145 and PC3 cells using Real-time PCR. Results: 1) based on the 11 sample sets used for cBioPortal modulation, KHDRBS2 and 3 were compared to KHDRBS1, KHDRBS2 and 3 were PCa The genetic changes in the sample set occur more widely, and KHDRBS3 can affect the total survival of the patients in the sample collection, suggesting that KHDRBS2 and 3 may be associated with the development of.2 associated with the development of PCa. All of the samples are in the set of NEPC samples of the castrated and castrated neuroendocrine prostate cancer, and the KHDRBS1,2 and the 3 genes have changed. The proportion of the samples was the highest, suggesting that the KHDRBS family might be associated with the progression of prostatic cancer in.3). K KHDRBS1 expressed KHDRBS2 high expression in.22RV1 cells in 22RV1, LnCap, DU145 and PC3, while PC3 cells expressed low expression and expressed high expression. The expression of the two was specific to cell type. Two 3 methods of action on prostate cancer cells: 1) the expression level of KHDRBS2 and 3 in 22RV1 and PC3 cells was altered by transient transfection and lentivirus transfection, and the cell cycle, migration, invasion and proliferation of.2 in vitro and in vivo were detected by Muse cytometer, Transwell and CCK-8 and in vivo tumorigenesis. The expression level of KHDRBS2 and 3 in 22RV1 and PC3 cells was changed by the same method. Real-time PCR and Western-Blot were used to detect the changes of KHDRBS2 and 3 in the corresponding cells, and the relationship between KHDRBS2 and 3 in prostate cancer cells. Results: 1) transient overexpression could successfully construct PC3 and 22RV1 cell models with high expression of KHDRBS2 and 3; 2) transfection of lentivirus Knockout KHDRBS2 or 3 can successfully construct a PC3 cell model with low expression of KHDRBS2 22RV1 or low expression KHDRBS3; 3) knock down KHDRBS2 can inhibit the proliferation of 22RV1 cells, while knockout KHDRBS3 can inhibit the proliferation of PC3 cells; 4) the expression of overexpression or knockout KHDRBS2 decreases or increases in mRNA and protein levels. The expression level of KHDRBS2 was also reduced or increased after overexpression or subtraction of KHDRBS3, but the expression of KHDRBS2 or 3 had no effect on the expression level of KHDRBS 1. Three, the relationship between the KHDRBS family and androgen receptor: 1) the use of Real-time PCR to detect 22RV1, LnCap, DU145 and PC3 cells, and the expression of water. In the presence of androgen and AR antagonists, 22RV1 cells AR-FL, 22RV1 cells AR-FL, AR-V7 and AR-V567es, and KHDRBS1,2 and 3 expression level.3 in 22RV1 and PC3 cells were detected by Real-time PCR. Under conditions, Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of KHDRBS2 and 3 in KHDRBS2 and 3 22RV1 cells and the expression of KHDRBS2, KHDRBS3, AR and AR-V7 in the 22RV1 cells that knocked down KHDRBS2. The expression level of AR, AR-V7, AR-V567es, KHDRBS1 and 2 in the 22RV1 cells was significantly higher than that in the normal culture group, with statistical significance, although KHDRBS3 had a tendency to increase, but there was no statistical significance. In PC3, the same treatment had no effect on the expression of KHDRBS family gene; 3) reducing KHDRBS2 significantly reduced the AR-V7 table in 22RV1 cells. Level, P value is 0.0168.4) over expression of KHDRBS2 and 3, and KHDRBS2 knockout 22RV1 cells, no matter whether or not adding androgens, KHDRBS2, KHDRBS3, AR and AR-V7, the expression of mRNA is consistent with that of the 22RV1 cells that have not been expressed and knocked down. The progression of adenocarcinoma and castration resistant prostate cancer has an important role in the development of.2. in 22RV1 and PC3 cells, KHDRBS2 and 3 expression has cell type specificity and the expression of AR and its isomers expresses a correlation of.3., KHDRBS2 or 3 can inhibit 22RV1 or PC3 cell proliferation.4. in 22RV1 and PC3 cells, and 3 The relationship between the expression of.5. and the up-regulated expression of KHDRBS1 and 2 may be mediated by AR-FL. Knockout KHDRBS2 can inhibit the expression of AR-V7 in 22RV1 cells,.KHDRBS1 and 2 may be a regulatory factor between AR-FL and AR-V7.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.25

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本文編號：2103533