本文選題：C14orf166 + Snail��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的探討炎癥細(xì)胞因子IL-8(interleukin-8)通過C14orf166調(diào)控Snail并促進(jìn)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)分子機(jī)制,解析C14orf166在乳腺癌疾病進(jìn)程中的作用。方法1、將乳腺癌細(xì)胞株MCF-7/SK-BR-3分為以下四組:PBS、IL-8、IL-8+LY294002(PI3K/Akt信號通路抑制劑)及IL-8+DMSO,采用免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting,WB)和半定量PCR(Semi-quantitative Real-time PCR)檢測C14orf166表達(dá)情況;并在乳腺癌細(xì)胞中加入C14orf166特異性化學(xué)合成小干擾RNA(Small interfering RNA,si RNA),觀察Snail蛋白水平是否受IL-8的調(diào)控。2、在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SK-BR-3中轉(zhuǎn)染C14orf166特異性si RNA或過表達(dá)質(zhì)粒(p CMV-tag2B-C14orf166),采用Western blotting及實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-PCR)觀察Snail及EMT相關(guān)分子標(biāo)志物E-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白水平變化,同時通過劃痕試驗(yàn)(Scratch assay)和侵襲試驗(yàn)(Transwell assay)檢測細(xì)胞侵襲、遷移功能變化。3、在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)C14orf166,同時用翻譯抑制劑放線菌酮(Cycloheximide,CHX)處理乳腺癌細(xì)胞,通過Western blotting及灰度值掃描,檢測Snail半衰期變化,確定C14orf166是否調(diào)控Snail翻譯,IL-8是否能上調(diào)乳腺癌細(xì)胞磷酸化Snail(p-Snail(S246))。加入C14orf166 sh RNA慢病毒或過表達(dá)C14orf166,Western blotting觀察p-Snail水平,并進(jìn)一步分離核漿蛋白觀察p-Snail在核漿分布變化情況。4、用C14orf166 sh RNA慢病毒感染乳腺癌細(xì)胞MCF-7,嘌呤霉素(Puromycin)篩選C14orf166穩(wěn)定干擾細(xì)胞株,接種至裸鼠脂肪墊,待成瘤后于原位注射PBS或IL-8,觀察腫瘤體積變化。4周后處死小鼠,取移植瘤小鼠腫瘤及肝、肺組織,通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)方法觀察C14orf166、Snail、p-Snail及EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的變化。HE染色觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。5、收集乳腺癌及正常乳腺組織臨床標(biāo)本,通過IHC技術(shù)檢測CXCRB、C14orf166、Snail及EMT分子標(biāo)志物等表達(dá)水平,以及分析與腫瘤惡性程度和遷移轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。通過Kaplan-Meier Plotter分析,預(yù)測C14orf166表達(dá)水平與乳腺癌病人生存的相關(guān)性。結(jié)果1、Western blotting及半定量PCR結(jié)果均表明,PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002可抑制IL-8對C14orf166的上調(diào)。當(dāng)C14orf166被特異性干擾,IL-8則失去上調(diào)Snail的能力。2、Western blotting結(jié)果表明,在MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞中敲減C14orf166,Snail蛋白水平明顯下降,同時上皮標(biāo)志物隨之上升,而間質(zhì)標(biāo)志物隨之下降,細(xì)胞侵襲遷移能力明顯受到抑制;在MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞中過表達(dá)C14orf166,Snail蛋白水平明顯上升,同時EMT相關(guān)標(biāo)志物也發(fā)生了相應(yīng)變化,細(xì)胞侵襲遷移能力明顯上升。然而,定量PCR結(jié)果表明,Snail的m RNA水平在這兩種處理因素下并未受到明顯影響。3、Western blotting結(jié)果表明,CHX處理細(xì)胞后,C14orf166過表達(dá)組中Snail半衰期明顯延長,且p-Snail在IL-8刺激后隨時間上升。當(dāng)敲減C14orf166時,p-Snail蛋白水平隨之下降,并在細(xì)胞核中分布減少。同時,當(dāng)過表達(dá)C14orf166時,p-Snail蛋白水平也隨之上升,在細(xì)胞核中聚集增多。4、IL-8能促進(jìn)乳腺癌移植瘤小鼠腫瘤生長,當(dāng)干擾C14orf166時,IL-8對乳腺腫瘤的促進(jìn)作用明顯受到抑制。IHC結(jié)果證明,IL-8可在體內(nèi)促進(jìn)C14orf166、Snail、p-Snail、Vimentin及Fibronectin的表達(dá),抑制E-cadherin的表達(dá),而C14orf166的缺失明顯抑制了IL-8引起的上述變化。IL-8能促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移,而C14orf166的缺失抑制了乳腺癌發(fā)生肝肺轉(zhuǎn)移。5、IHC染色表明,隨著乳腺組織惡性程度增加,CXCRB、C14orf166、Snail、Vimentin、Fibronectin表達(dá)明顯增強(qiáng),E-cadherin表達(dá)明顯減弱。生存曲線表明,高水平的C14orf166與乳腺癌病人高死亡率具有明顯相關(guān)性。結(jié)論1、IL-8通過PI3K/Akt通路上調(diào)C14orf166而介導(dǎo)Snail的表達(dá)。2、C14orf166在乳腺癌細(xì)胞中通過調(diào)控Snail而影響乳腺癌細(xì)胞EMT發(fā)生及細(xì)胞功能變化。3、C14orf166對乳腺癌細(xì)胞侵襲遷移功能的影響是通過調(diào)控p-Snail核轉(zhuǎn)位發(fā)揮作用的。4、體內(nèi)試驗(yàn)證明,干擾C14orf166可抑制乳腺癌生長及侵襲轉(zhuǎn)移。5、臨床標(biāo)本中,C14orf166與乳腺癌惡性程度的相關(guān)基因表達(dá)具有明顯相關(guān)性,且高水平的C14orf166可促進(jìn)乳腺癌患者死亡率升高。
[Abstract]:Objective to investigate the role of inflammatory cytokine IL-8 (interleukin-8) to regulate Snail by C14orf166 and to promote the molecular mechanism of Epithelial-mesenchymal transition (EMT), and to analyze the role of C14orf166 in the process of breast cancer. Method 1, the breast cancer cell strains are divided into four groups: PBS, IL-8, IL-8+LY294002 ( PI3K/Akt signaling pathway inhibitors) and IL-8+DMSO were detected by Western blot test (Western blotting, WB) and semi quantitative PCR (Semi-quantitative Real-time PCR), and C14orf166 specific chemical synthesis was added to the breast cancer cells to observe whether the protein level was affected. The regulatory.2 of IL-8 was transferred to the C14orf166 specific Si RNA or the overexpressed plasmid (P CMV-tag2B-C14orf166) in the breast cancer cell line MCF-7 and SK-BR-3. The cell invasion was detected by the scratch test (Scratch assay) and the invasion test (Transwell assay), the migration function was changed.3, the C14orf166 was overexpressed in the breast cancer cells, and the breast cancer cells were treated with the translation inhibitor actinomycone (Cycloheximide, CHX). The Snail half life changes were detected by the Western blotting and the gray value scan, and C14 was determined. Whether or not orf166 regulates Snail translation, whether IL-8 can increase the phosphorylation of Snail (p-Snail (S246)) in breast cancer cells. C14orf166 sh RNA lentivirus or overexpression C14orf166. Cells MCF-7, purinamycin (Puromycin) screening C14orf166 stable interference cell lines, inoculated into the nude mouse fat pad, after the tumor to be injected in situ PBS or IL-8, observe the tumor volume.4 weeks after the death of mice, take the tumor and liver, lung tissue of the transplanted tumor mice, observe C14orf166, Snail, through the immunohistochemical (immunohistochemistry, IHC) method. P-Snail and EMT related molecular markers change.HE staining to observe tumor metastasis.5, collect breast cancer and normal breast tissue clinical specimens, detect the expression level of CXCRB, C14orf166, Snail and EMT molecular markers by IHC technique, and analyze the correlation with tumor malignancy and migration and metastasis. Kaplan-Meier Plotter score. The correlation between C14orf166 expression level and the survival of breast cancer patients was predicted. Results 1, Western blotting and semi quantitative PCR results showed that the PI3K/Akt signaling pathway inhibitor LY294002 inhibited the up-regulated IL-8 on C14orf166. When C14orf166 was specifically disturbed, IL-8 lost the Snail capacity.2. The level of C14orf166, Snail protein in SK-BR-3 cells decreased and the epithelial markers increased, while the interstitial markers decreased, and the cell invasion and migration ability was obviously inhibited. In MCF-7, SK-BR-3 cells overexpressed C14orf166, the level of Snail protein increased obviously, and the EMT related markers changed correspondingly. The ability of cell invasion and migration increased significantly. However, quantitative PCR results showed that the m RNA level of Snail was not significantly affected by.3, and Western blotting results showed that the Snail half life of C14orf166 overexpression group was obviously prolonged after CHX processing cells, and p-Snail was increased after IL-8 stimuli. The level of p-Snail protein decreased and decreased in the nucleus. At the same time, when the C14orf166 was expressed, the level of p-Snail protein increased, and the accumulation of.4 in the nucleus was increased. IL-8 could promote the growth of the tumor of breast cancer transplanted mice. When the C14orf166 was disturbed, the effect of IL-8 on breast cancer was obviously inhibited by.IHC. IL-8 can promote the expression of C14orf166, Snail, p-Snail, Vimentin and Fibronectin in the body, and inhibit the expression of E-cadherin, and the absence of C14orf166 obviously inhibits the above changes caused by IL-8.IL-8 can promote the metastasis of breast cancer, while C14orf166 deletion inhibits the liver and lung metastasis.5 of breast cancer. The expression of CXCRB, C14orf166, Snail, Vimentin, Fibronectin was obviously enhanced and the expression of E-cadherin decreased obviously. The survival curve showed that the high level of C14orf166 had a significant correlation with the high mortality rate of breast cancer patients. Conclusion 1, IL-8 is promoted by PI3K/Akt pathway up C14orf166 and mediates Snail expression.2. The effect of EMT on breast cancer cells and cell function changes by regulating Snail is.3. The effect of C14orf166 on the invasion and migration of breast cancer cells is.4 that regulates the role of p-Snail nuclear transposition. In vivo experiments have shown that interference with C14orf166 can inhibit the growth and invasion of breast cancer, and in clinical specimens, C14orf166 and malignant progression of breast cancer There was a significant correlation between the degree of gene expression and the high level of C14orf166 in patients with breast cancer.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

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