本文選題：自然殺傷細胞 + 體外擴增��； 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：背景自然殺傷細胞(natural killer, N K細胞),是一群大顆粒淋巴細胞,在抗腫瘤及感染免疫方面發(fā)揮著重大的作用。NK細胞通過其表面的活化性及抑制性受體識別靶細胞,活化性及抑制性信號的平衡決定了NK細胞介導的細胞毒作用。NK細胞對表達下調(diào)或缺失主要組織相容復合體-I(major histocompatibility complex class I, MHC-I)的靶細胞(腫瘤細胞及受感染細胞)發(fā)揮快速的自然殺傷,而不需要預先致敏。隨著對NK細胞生物活性的進一步了解,以NK細胞為基礎的免疫治療在臨床應用中有所發(fā)展和提高并且已經(jīng)在腫瘤患者包括血液系統(tǒng)腫瘤中得以應用并取得了一定的療效。根據(jù)NK細胞識別靶細胞的"missing-self"理論,異體較自體NK細胞具有更強的抗靶細胞的生物活性。NK細胞占外周淋巴細胞的5-15%。自體或異體NK細胞治療的主要瓶頸之一是體外擴增的效率。因此,開發(fā)一個有效活化和擴增NK細胞的方法以獲得足夠數(shù)量和高效能的NK細胞是非常重要的。CD16屬于Fcγ受體的一種類型,它是免疫球蛋白Fc段的低親和力受體(FcyRIIIa), NK細胞上CD16與CD16激動劑即抗CD16抗體相結(jié)合能夠引起NK細胞的活化而發(fā)揮NK細胞對抗腫瘤細胞的細胞毒活性并且釋放細胞因子,比如干擾素γ (IFN-y)。此外,近期有研究提出通過抑制ADAM金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域17(ADAM metallopeptidase domain 17, AD AM17)阻斷CD16分裂可以促進NK細胞對腫瘤的敏感性。因此,激活CD16信號通路應是一個有效的活化與擴增NK細胞的方法。通過抗體阻斷免疫檢查點分子途徑,如程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD1)與它的配體PD-L1及PD-L2的連接而阻斷抑制信號的傳遞在多種實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤中都取得了巨大的成功。PD1是一種細胞膜蛋白受體,與表達于抗原遞呈細胞上的PD-L1/2相互作用而傳遞抑制性信號,這在誘導和維持外周免疫耐受的負性調(diào)控免疫應答途徑中起重要的作用。T細胞在腫瘤患者的腫瘤微環(huán)境中經(jīng)常被誘導性表達PD1,它與腫瘤細胞上表達的PD-L1連接,阻斷T細胞介導的腫瘤細胞殺傷。PD1陽性的T細胞被認為是一群“疲乏”的T細胞,特征是功能效應和擴增指數(shù)減退。除此之外,源于多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)的NK細胞也表達PD1。既然PD1分子在T細胞的發(fā)展中可以被誘導表達,那么可以推測在體外NK細胞的活化和擴增過程中PD1的表達也可能會有所提高。因此,評估NK細胞擴增體系中PD1的表達和NK細胞的功能變化與PD1阻斷的聯(lián)系是很有意義的。多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種漿細胞克隆性增生性疾病,是來源于終末分化的B淋巴細胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤,以骨質(zhì)破壞和異常免疫球蛋白大量生成為特征。隨著新型抗骨髓瘤藥物的發(fā)展和臨床應用,如蛋白酶體抑制劑硼替佐米及免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺,MM的治療效果已經(jīng)顯著提高,但是依然不能治愈。類似于其他惡性腫瘤,由于微小病灶(minimal residue disease, MRD)中的腫瘤細胞對傳統(tǒng)化療不敏感,腫瘤的復發(fā)難以控制。免疫治療包括NK細胞輸注聯(lián)合PD1/PD-L1/2途徑阻斷或許能夠為消除MM及其他腫瘤的MRD提供很有意義的治療方法。目的：研究體外高效擴增正常人外周血NK細胞的方法并通過其對骨髓瘤細胞株RPMi8226細胞的殺傷進行功能檢測；探討PD1阻斷對體外擴增的NK細胞對抗骨髓瘤細胞的活性及功能的影響并進行機制研究；觀察NK細胞輸注聯(lián)合應用PD1阻斷對多發(fā)性骨髓瘤小鼠皮下移植瘤生長及生存時間的影響。方法1.研究人外周血自然殺傷細胞體外高效擴增的方法并進行功能檢測1.1人外周血自然殺傷細胞體外高效擴增的方法：采用淋巴細胞分離液分離正常人外周血單個核細胞,重懸于全培養(yǎng)液,以1×106/ml的濃度種植于孔板中,并向體系內(nèi)加入CD16抗體和重組人白介素-2(IL-2)刺激NK細胞生長,37℃培養(yǎng)箱中孵育,定期更換培養(yǎng)液,添加新鮮IL-2,直至培養(yǎng)周期結(jié)束。1.2體外檢測擴增NK細胞的活性及其對抗骨髓瘤細胞株RPMI8226的能力：在擴增第14天和21天分別收集NK細胞,臺盼藍計數(shù)并觀察存活率,流式細胞術檢測NK細胞純度及活化性受體(NKp44,NKp46,NKG2D)和抑制性受體(CD158a,CD158b,NKB1)的表達。分別以慢性粒細胞白血病細胞株K562和多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226為靶細胞,CD107a易位表達檢測NK細胞的脫顆粒能力,并進行PKH26和Annexin-V標記靶細胞檢測NK細胞的殺傷功能。2. 體外檢測PD1/PD-L1/L2途徑阻斷對擴增NK細胞效應功能的影響2.1體外抗體阻斷PD-L1/2檢測其對NK細胞細胞毒作用的影響：流式細胞術檢測RPMI8226細胞上PD-L1和PD-L2的表達,確定其表達后,PMI8226與不同濃度的PD-L1和PD-L2抗體共培養(yǎng)2小時,作為MTT實驗的靶細胞檢測擴增NK細胞對其殺傷能力。2.2檢測PD1在擴增NK細胞上的表達及抗體阻斷PD1對NK細胞功能的影響：流式細胞術分別檢測擴增第0天,14天和21天NK細胞上PD1的表達,在擴增第7天向體系中添加濃度為2.5 μg/ml的抗PD1抗體,繼續(xù)培養(yǎng)至21天,收集NK細胞(exNK+PD1 blockage),臺盼藍計數(shù)觀察存活率,流式細胞術檢測NK細胞脫顆粒能力及對RPMI8226細胞的殺傷功能,觀察PD1阻斷對NK細胞效應的影響,并檢測NK細胞上活化性受體的表達。3.體內(nèi)實驗檢測擴增NK細胞對多發(fā)性骨髓瘤SCID小鼠的抗瘤作用3.1建立SCID鼠多發(fā)性骨髓瘤模型：準備16只6-8周齡的SCID雌性小鼠,收集對數(shù)生長期的RPMI8226細胞,將細胞以1×108cells/ml的濃度重懸于生理鹽水,每只小鼠前肢背部皮下接種100μl RPMI8226細胞懸液,當腫瘤體積達到約300 mm3時開始進行治療。3.2觀察擴增NK細胞及聯(lián)合PD1/PD-L1/2途徑阻斷抑制荷瘤小鼠骨髓瘤生長的能力：隨機將16只符合條件的荷瘤小鼠分配為生理鹽水(NS, control)、擴增NK細胞(exNK cells)、PD1阻斷的NK細胞(exNK+PD1 blockage)以及擴增NK細胞+PD-L2抗體(exNK+PD-L2 blocking)四組。除對照組外,每組輔以腹腔注射IL-2,NK細胞經(jīng)尾靜脈注射,PD-L2抗體瘤內(nèi)注射。觀察荷瘤小鼠腫瘤體積變化及生存時間,荷瘤小鼠不能爬行時處死小鼠作為實驗終止點。結(jié)果1.研究人外周血自然殺傷細胞體外高效擴增的方法并進行功能檢測1.1健康供者PBMCs的NK細胞擴增：結(jié)果顯示經(jīng)過CD16及IL-2培養(yǎng)的NK細胞獲得了高效擴增。擴增第21天,PBMCs擴增倍數(shù)達1002.2±394.53倍,流式細胞術檢測NK細胞純度為79.6%±3.7%,第14天和21天,NK細胞擴增倍數(shù)分別達到549.9±154.7倍和4011.5±1082.4倍。1.2擴增NK細胞的活性及其對抗骨髓瘤細胞株RPMI8226的能力增強：擴增NK細胞臺盼藍計數(shù)顯示其全部存活,流式細胞術檢測NK細胞活化性受體和抑制性受體的表達都明顯提高,對K562和RPMI8226細胞的脫顆粒能力也分別提高至38.12%±6.16%和36.25%±7.69%,對RPMI8226細胞的殺傷能力在效靶比為0.3：1和1：1時分別提高至27.93%±3.33%和59.1%±3.6%。2. PD1/PD-L1/L2途徑阻斷增強了擴增NK細胞的效應功能2.1 PD-L1和PD-L2的抗體阻斷加強了擴增NK細胞的細胞毒性：流式細胞術檢測顯示RPMI8226細胞上PD-L1和PD-L2的表達分別為58.5%±13.0%和73.1%±7.5%。RPMI8226細胞與PD-L1及PD-L2抗體共培養(yǎng)后作為靶細胞檢測NK細胞功能,結(jié)果顯示經(jīng)較低濃度(1.25μg/ml)抗PD-L1抗體處理的細胞比不加抗體和較高濃度(2.5μg/m1)處理的細胞在殺傷時誘導更顯著的RPMI8226細胞裂解(P0.05)。阻斷PD-L2的抗體濃度為2.5μg/ml和5.0μg/ml,相應的RPMI8226細胞的死亡率分別為31.2%±6.6%和24.1%±3.9%,但是在PD-L2的阻斷實驗中并沒有發(fā)現(xiàn)劑量依賴性。2.2 PD1在擴增NK細胞上的表達升高及PD1阻斷增強了擴增NK細胞對抗骨髓瘤細胞的脫顆粒及溶細胞活性：流式細胞術測定結(jié)果顯示PD1很少表達于靜息的NK細胞即擴增第0天的NK細胞,但是隨著擴增過程的延長,PD1的表達呈逐漸上升趨勢,第21天約26%的NK細胞表達PD1。在擴增體系中加入抗PD1抗體顯著提高了NK細胞對RPMI8226靶細胞的脫顆粒效應,阻斷PD1的NK細胞(exNK+PD1 blockage)較對照組(exNK)呈現(xiàn)出更高比例的CD107a陽性細胞(CD3"CD56+CD107a+,64.0%±1.0% vs.53.1%±2.7%, P0.05)。ExNK+PD1 blockage與exNK相比更加顯著地誘導RPMI8226細胞的凋亡(63.2%±6.2% vs.44.9%±7.5%, P0.05)。為了探討這種差異的機制,進一步檢測活化性受體的表達,結(jié)果證實PD1阻斷后,exNK+PD1 blockage上活化性受體NKp44、NKp46及NKG2D的表達明顯高于exNK組,推測其可能為PD1阻斷增強NK細胞效應的機制之一。3.擴增NK細胞體內(nèi)抑制骨髓瘤細胞生長并延長荷瘤小鼠的生存時間皮下注射RPMI8226細胞,2-3周后16只小鼠的腫瘤體積都達到300mm3左右。荷瘤小鼠隨機分配至為NS、exNK、exNK+PD1 blockage以及exNK+PD-L2 blocking四組,結(jié)果顯示對照組小鼠的腫瘤生長速度明顯快于其他三組,而exNK組和exNK+PD1 blockage組抑制腫瘤生長的效果要優(yōu)于exNK+PD-L2 blocking組。治療后的第2、3、4周,治療組所有小鼠的腫瘤都明顯小于對照組。為了檢測NK細胞聯(lián)合PD1/PD-L1阻斷治療的效果,我們比較了治療后對照組第一只小鼠死亡時間點即第28天時四組腫瘤細胞的大小。結(jié)果顯示exNK組、exNK-PD1 blockage組及exNK+PD-L2 blocking組的腫瘤體積要明顯小于對照組,并且exNK+PD1 blockage組比exNK組表現(xiàn)出更有效的抑制腫瘤生長的效果,exNK+PD1 blockage組的腫瘤體積為1297.0±118.1mm3,而exNK組的腫瘤體積為2747.2±568.8mm3。我們又進一步對比了對照組與治療組荷瘤小鼠的生存時間,結(jié)果顯示對照組、exNK組、exNK+PD-L2 blocking組及exNK+PD1 blockage組的平均生存時間分別是30天、44天、49天及57天。對照組中最后一只荷瘤小鼠的死亡時間是第36天。而exNK組、exNK+PD-L2 blocking組及exNK+PD1 blockage組第一只小鼠的死亡時間分別是第35、42及47天。治療后第53天,所有的小鼠都已死亡,三個治療組與對照組相比都明顯延長了荷瘤小鼠的生存時間。經(jīng)exNK+PD1 blockage治療的小鼠存活時間明顯長于對照組(P0.01)和exNK組(P0.05)治療的小鼠,而只略長于exNK+PD-L2 blockage組(P0.05)。結(jié)論1.CD16抗體和IL-2聯(lián)合應用可以高效擴增NK細胞,其純度(70%)和倍數(shù)(4000倍)達到理想效果,活化性受體和抑制性受體的表達上調(diào),并且能夠有效殺傷K562和RPMI8226細胞。2. RPMI8226細胞高表達PD-L1/2, PD1在NK細胞上的表達隨培養(yǎng)周期延長而上調(diào),體外阻斷PD1-PDL1/2途徑能夠增強NK細胞對抗骨髓瘤細胞的脫顆粒及溶細胞能力,其機制可能與活化性受體表達升高有關。3.NK細胞及聯(lián)合抗體阻斷PD1/PD-L1/2途徑可以有效抑制體內(nèi)骨髓瘤細胞生長并延長荷瘤小鼠的生存時間。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.3

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本文編號：2088150