本文選題：非小細(xì)胞肺癌 + 表皮生長(zhǎng)因子　； 參考：《北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是目前我國(guó)和世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。近十幾年來(lái),分子靶向藥物的應(yīng)用逐漸增多,已經(jīng)成為晚期NSCLC的一線治療選擇。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是NSCLC常見(jiàn)的癌癥驅(qū)動(dòng)基因。表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)可以與EGFR酪氨酸激酶區(qū)域的ATP位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,抑制其活化及磷酸化,阻斷信號(hào)下傳,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,最終抑制腫瘤生長(zhǎng)。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的不同,EGFR-TKIs又可分為一代、二代和三代TKIs。盡管EGFR突變的晚期NSCLC患者接受EGFR-TKIs治療的有效率可達(dá)到60%~80%,但大多數(shù)患者最終都會(huì)不可避免地出現(xiàn)對(duì)EGFRTKI的耐藥,即繼發(fā)性耐藥。目前研究認(rèn)為,EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥的主要機(jī)制如下:1.EGFR耐藥突變,如T790M突變;2.EGFR下游通路相關(guān)分子的激活或編碼基因突變;3.其他細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因或蛋白表達(dá)異常;4.腫瘤組織上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)或向小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化。但對(duì)于非EGFR耐藥突變的耐藥機(jī)制,仍然有諸多不明朗之處,尤其是對(duì)二代和三代TKIs藥物,由于應(yīng)用時(shí)間尚短,耐藥機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。深入了解EGFR-TKIs的耐藥機(jī)制,對(duì)TKIs的個(gè)體化治療、預(yù)后判斷、早期發(fā)現(xiàn)耐藥患者、延緩或逆轉(zhuǎn)耐藥有著重要的意義。本研究中,我們選擇EGFR 19外顯子缺失突變的HCC827細(xì)胞系和同時(shí)具有21外顯子L858R突變和20外顯子T790M的NCI-H1975細(xì)胞,誘導(dǎo)并建立這兩個(gè)細(xì)胞系對(duì)三代不同EGFR-TKIs(一代TKIs:吉非替尼;二代TKIs:阿法替尼;三代TKIs:AZD9291)的繼發(fā)性耐藥模型,為體外誘導(dǎo)TKIs耐藥NSCLC探尋方法,并對(duì)耐藥株EGFR和下游MAPK信號(hào)通路的蛋白表達(dá)及調(diào)節(jié)進(jìn)行了檢測(cè),以探究TKIs體外耐藥的可能機(jī)制。方法在第一部分實(shí)驗(yàn)中,為驗(yàn)證HCC827細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞的真實(shí)性,我們先用測(cè)序法檢測(cè)了這兩株細(xì)胞EGFR 19-21外顯子的突變,并用MTS法檢測(cè)了吉非替尼、阿法替尼和AZD9291對(duì)這兩株細(xì)胞的增殖抑制率,計(jì)算出相應(yīng)的IC50。接下來(lái),我們同時(shí)使用3種方法((1)間歇高濃度沖擊、逐漸增加維持濃度法,(2)濃度遞增法,(3)持續(xù)高濃度篩選法)試圖誘導(dǎo)出對(duì)TKIs耐藥的細(xì)胞株。獲得耐藥株后,我們用MTS法檢測(cè)了藥物對(duì)相應(yīng)耐藥株的增殖抑制率,并計(jì)算IC50;為除外耐藥株的IC50升高并非細(xì)胞狀態(tài)不佳導(dǎo)致,我們又繪制了不同藥物濃度下耐藥細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線,并與親本細(xì)胞株進(jìn)行比較。在實(shí)驗(yàn)的第二部分中,為對(duì)耐藥株的耐藥機(jī)制進(jìn)行探討,我們又對(duì)耐藥株的EGFR及其下游信號(hào)通路的蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè),并與親本細(xì)胞株進(jìn)行比較。我們首先用Western Blot方法檢測(cè)了不同濃度藥物下阿法替尼耐藥株(HCC827/AR)和AZD9291耐藥株(HCC827/AZDR)的EGFR和p Y1068-EGFR蛋白表達(dá),并與親本細(xì)胞株進(jìn)行比較,再用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。我們用Western Blot方法檢測(cè)了不同濃度藥物下HCC827/AR和HCC827/AZDR MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)與親本細(xì)胞株的差異;在發(fā)現(xiàn)HCC827/AZDR細(xì)胞株存在MAPK信號(hào)通路持續(xù)活化后,我們用高選擇性MEK抑制劑(曲美替尼)和ERK抑制劑(SCH772984)分別作用于HCC827/AZDR細(xì)胞,用Western Blot方法觀察MAPK信號(hào)通路下游蛋白ERK磷酸化的情況;又用MTS增殖抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了曲美替尼對(duì)AZD9291活性的影響。結(jié)果在實(shí)驗(yàn)的第一部分,我們驗(yàn)證了HCC827細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞后,用間歇高濃度沖擊、逐漸增加維持濃度法誘導(dǎo)了HCC827吉非替尼耐藥株(HCC827/GR),經(jīng)過(guò)三輪沖擊維持,最終吉非替尼維持濃度為300n M,細(xì)胞可正常生長(zhǎng)。MTS增殖抑制實(shí)驗(yàn)法顯示相同濃度的吉非替尼對(duì)HCC827/GR的抑制率始終低于親本細(xì)胞株(P0.05)。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)顯示HCC827/GR細(xì)胞在吉非替尼30n M時(shí)生長(zhǎng)速度和不加藥一致(P0.05),但在吉非替尼300n M時(shí)生長(zhǎng)速度比不加藥時(shí)慢(P0.05)。在濃度遞增法持續(xù)誘導(dǎo)7個(gè)月后,我們獲得了阿法替尼耐藥株HCC827/AR,阿法替尼維持濃度為16n M,細(xì)胞可正常生長(zhǎng)。MTS增殖抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)得HCC827/AR的IC50為4667 n M,耐藥指數(shù)1866.8。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)顯示HCC827/AR的生長(zhǎng)速度與親本細(xì)胞株無(wú)明顯差異,在阿法替尼16n M時(shí)生長(zhǎng)速度和沒(méi)有藥物作用時(shí)一致(P0.05)。經(jīng)過(guò)6個(gè)月的間歇高濃度沖擊、逐漸增加維持濃度,我們最終獲得了AZD9291耐藥株HCC827/AZDR,維持濃度為160n M,細(xì)胞可正常生長(zhǎng)。MTS增殖抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)得HCC827/AZDR的IC50為6116 n M,耐藥指數(shù)459.8。生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)顯示HCC827/AZDR的生長(zhǎng)速度與親本細(xì)胞株無(wú)差異,在AZD9291 160n M時(shí)的生長(zhǎng)速度和不加藥組一致(P0.05)。實(shí)驗(yàn)的第二部分中,Western Blot結(jié)果顯示耐藥株HCC827/AR細(xì)胞和HCC827/AZDR細(xì)胞的EGFR的蛋白含量和p Y1068位點(diǎn)磷酸化水平均比親本細(xì)胞株明顯降低(P0.01)。隨著阿法替尼或AZD9291濃度的增高,HCC827細(xì)胞、HCC827/AR細(xì)胞和HCC827/AZDR細(xì)胞的p Y1068-EGFR水平減低,EGFR表達(dá)水平增高(P0.05)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示與親本細(xì)胞相比,HCC827/AZDR細(xì)胞的EGFR和p Y1068-EGFR水平降低。與親本細(xì)胞相比HCC827/AR細(xì)胞的p MEK蛋白含量降低,與阿法替尼藥物濃度的變化無(wú)量效關(guān)系;p ERK 1/2的表達(dá)水平降低,與阿法替尼的藥物濃度無(wú)量效關(guān)系。與親本細(xì)胞比,HCC827/AZDR細(xì)胞的p MEK水平升高,AZD9291濃度增加不能降低p MEK的表達(dá);p ERK 1與親本細(xì)胞株無(wú)明顯差異;p ERK 2的蛋白含量明顯升高,AZD9291作用的濃度增加不能降低p ERK 2的蛋白含量。曲美替尼在10n M可明顯降低HCC827/AZDR的p ERK 1/2表達(dá)(P0.05);SCH772894在100n M濃度時(shí)可抑制HCC827/AZDR的p ERK1/2表達(dá)(P0.05)。但MTS增殖抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)曲美替尼10n M濃度下AZD9291的IC50為6215n M,與AZD9291單藥測(cè)定的IC50無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論1.我們通過(guò)濃度遞增法成功獲得了耐阿法替尼的HCC827/AR細(xì)胞株,通過(guò)間歇高濃度沖擊、逐漸增加維持濃度法獲得了耐AZD9291的HCC827/AZDR細(xì)胞株。2.HCC827/AR和HCC827/AZDR耐藥細(xì)胞中,EGFR的表達(dá)和p Y1068位點(diǎn)磷酸化水平均比親本細(xì)胞株明顯降低,研究表明HCC827/AR和HCC827/AZDR細(xì)胞株可能通過(guò)下調(diào)EGFR的表達(dá)引起對(duì)EGFR-TKIs的耐藥。3.HCC827/AZDR耐藥株與親本細(xì)胞相比出現(xiàn)了MAPK信號(hào)通路的持續(xù)高水平激活。但應(yīng)用曲美替尼并不能改善HCC827/AZDR細(xì)胞對(duì)AZD9291的耐受性,MAPK信號(hào)通路的持續(xù)活化不是HCC827/AZDR耐藥的關(guān)鍵機(jī)制。
[Abstract]:EGFR - TKIs ( epidermal growth factor receptor , EGFR ) is one of the most common cancer - driven genes in NSCLC . EGFR - TKIs can be divided into one - generation , second - generation and three - generation TKIs . In the second part of the experiment , we examined the expression of EGFR and p - YG8 - EGFR in vitro and compared the expression and regulation of EGFR and p The growth rate of HCC827 / AZDR was significantly lower than that of parent cell line ( P0.05 ) . The continuous activation of MAPK signaling pathway is not a key mechanism for HCC827 / AZDR resistance .
【學(xué)位授予單位】：北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2

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