本文選題：Notch通路 + 煙草��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：背景肺癌嚴(yán)重危害人類健康,其發(fā)病率和死亡率均居全球癌癥首位。肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性比較復(fù)雜,且惡性程度高,約75%的肺癌患者被確診時(shí)已屬中晚期。因此深入研究肺癌發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵的病因及分子機(jī)制,以尋找早期診斷,早期干預(yù)的措施,對(duì)改善肺癌的預(yù)后具有十分重要意義。吸煙是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的最重要危險(xiǎn)因素,大量流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)約90%肺癌相關(guān)死亡病例與吸煙有關(guān)。與非吸煙者相比,吸煙可使肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)升高30倍。此外,吸煙也是肺癌手術(shù)患者預(yù)后差的因子。卷煙煙氣中尼古丁、4-甲基亞硝胺基-3吡啶-1-丁酮(NNK)和多環(huán)芳烴等70多種致癌物[8],可通過影響細(xì)胞受體、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)控制因子、信號(hào)通路、凋亡調(diào)節(jié)因子、血管生成因子等的改變導(dǎo)致肺癌的發(fā)生以及侵襲和轉(zhuǎn)移。但其具體分子機(jī)制至今尚未完全闡明,限制煙草學(xué)研究的主要問題是影響因素多,構(gòu)建吸煙致癌模型較為困難、研究周期長等。但是闡明煙草致癌機(jī)制對(duì)科學(xué)預(yù)防和早期干預(yù)意義重大。Notch信號(hào)通路是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞和細(xì)胞之間直接接觸的重要信號(hào)通路之一,在細(xì)胞發(fā)育、生長和分化過程中發(fā)揮重要作用。Notch信號(hào)通路由4種受體、5種配體和下游的效應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子構(gòu)成。該通路在腫瘤中的作用近年來引起諸多學(xué)者的關(guān)注。與腫瘤發(fā)生發(fā)展較為密切的是Notch1、Notch2受體,Notch通路失調(diào)在腫瘤細(xì)胞生長、代謝、細(xì)胞周期及凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。宮頸癌、乳腺癌和肝癌中均發(fā)現(xiàn)Notch1異�；罨�,促進(jìn)腫瘤生長,但最近在膀胱癌研究中發(fā)現(xiàn),Notch通路通過抑制ERK通路發(fā)揮抑癌基因功能�？梢奛otch通路的調(diào)控異常復(fù)雜,取決于腫瘤遺傳學(xué)背景和外源性刺激信號(hào)。在肺發(fā)育早期,Notch通路分布在上皮細(xì)胞中,擔(dān)任促增殖,抑制細(xì)胞分化的角色,屬早期胚胎發(fā)育基因[15]。Notch活化對(duì)胚胎干細(xì)胞維持自我更新與多向分化潛能至關(guān)重要[16]。如果成熟機(jī)體內(nèi)Notch過度激活則會(huì)阻礙細(xì)胞正常分化,使上皮細(xì)胞極性紊亂而驅(qū)動(dòng)向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。有研究發(fā)現(xiàn)三分之一非小細(xì)胞肺癌患者(NSCLC)中出現(xiàn)Notch通路異常,異常激活的Notch通路和較差的預(yù)后密切相關(guān)[17],體外研究還發(fā)現(xiàn)Notch通路需要乏氧環(huán)境才能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲生長[18]。在急性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)現(xiàn)Notch通路存在激活突變,但在實(shí)體瘤中爭議較大,Notch突變?cè)诜伟┌l(fā)生中的作用有待證實(shí)。作為最重要的外源性刺激因素,吸煙對(duì)Notch通路的影響尚未見研究報(bào)道。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)探討了Notch通路在煙草誘導(dǎo)肺癌中的確切作用及其分子機(jī)制,為明確煙草致癌機(jī)制及高危人群的早期干預(yù)提供了關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分 煙草誘導(dǎo)肺癌發(fā)生模型的建立[目的]采用卷煙煙氣凝集物(cigarette smoke condensate,CSC)長期誘導(dǎo)人永生化人支氣管上皮細(xì)胞株(immortalized human bronchial epithelial cells)BEP2D惡性轉(zhuǎn)化,并接種裸鼠皮下成瘤；同時(shí)利用動(dòng)物吸煙機(jī)建立A/J小鼠煙熏成瘤模型[方法]1.利用CSC對(duì)人永生化支氣管上皮細(xì)胞BEP2D持續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)至70代,并用姬姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)、克隆形成率、生長曲線、血清抗性實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂克隆形成能力對(duì)惡性表型進(jìn)行觀察2.PO、酒精組細(xì)胞(溶媒對(duì)照)、P10、P30、P50、P70細(xì)胞分別加入凋亡誘導(dǎo)劑依托泊苷(Etoposide),24h后Annexin V-PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡3.Western blot檢測(cè)PO、酒精組、P10、P30、P50、P70細(xì)胞中抗凋亡蛋白家族(1AP)成員XIAP、Survivin、c-IAP-1、c-IAP-1和促凋亡蛋白R(shí)ARP表達(dá)4.P0、P50、P70細(xì)胞接種裸鼠,觀察成瘤情況,成瘤后測(cè)量瘤體大小,處死成瘤裸鼠,進(jìn)行HE染色和免疫組化染色鑒定5.以自發(fā)成瘤傾向的A/J小鼠為模型,隨機(jī)分為兩組(每組40只)即正常對(duì)照組和煙熏組,將小鼠置入專用動(dòng)物吸煙機(jī)中進(jìn)行煙氣暴露實(shí)驗(yàn),在煙熏前、1月、3月、9月每組分別取10只小鼠肺組織,進(jìn)行HE染色觀察肺部成瘤情況,通過免疫組化檢測(cè)抗凋亡蛋白XIAP、Survivin表達(dá),原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)小鼠肺組織和瘤體組織的細(xì)胞凋亡水平,觀察吸煙對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；小鼠煙熏成瘤后進(jìn)行HE和免疫組化染色進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]1.隨著染毒代數(shù)的增高,細(xì)胞出現(xiàn)病理性核分裂象,核漿比增大；P30、P40、 P50、P60、P70細(xì)胞增殖速度在24h、48h、72h顯著快于正常及酒精對(duì)照組細(xì)胞(P均0.05)；P20、P30、P40、P50、P60、P70細(xì)胞克隆形成率明顯高于P0及酒精對(duì)照組細(xì)胞(P均0.05)；同P0及酒精對(duì)照組相比,P30、P40 P50、P60、P70細(xì)胞均出現(xiàn)顯著的對(duì)血清促分化能力的抗性(P均0.05);P30、P40、P50、P60、P70細(xì)胞的軟瓊脂克隆形成隨著CSC染毒代數(shù)增高而增高,與P0及酒精對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)2.P0、酒精組細(xì)胞、P10、P30、P50細(xì)胞加入Etoposide后細(xì)胞凋亡率顯著增高(P均0.01)；P70細(xì)胞加入Etoposide后,兩組凋亡率無顯著差別(P0.05)3.XIAP、Surviving、在P50、P70細(xì)胞中表達(dá)高于其他各代細(xì)胞,RARP在P50、P70細(xì)胞中表達(dá)低于其他各代細(xì)胞；c-IAP-1、c-IAP-2表達(dá)水平在各代細(xì)胞無明顯差異4.惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞裸鼠接種模型顯示,P70細(xì)胞組接種4月后全部成瘤,PO和P50細(xì)胞組無成瘤。瘤體HE染色顯示：差分化腺癌,免疫組化顯示：CK7和TTF-1強(qiáng)陽性,CK56、P63和CKH均陰性,綜合上述分子標(biāo)志物表達(dá)證實(shí)裸鼠成瘤為腺癌5.A/J小鼠在9月時(shí)發(fā)生肺部腫瘤,10只全部成瘤,對(duì)照組均無成瘤,腫瘤HE染色提示：2例腺瘤,8例為腺癌,8例瘤體免疫組化染色提示：TTF-1強(qiáng)陽性,P63和CK56陰性,證實(shí)肺腺癌；與對(duì)照肺組織相比,腫瘤中XIAP和Survivin表達(dá)顯著增高(P0.01)；fUNEL染色提示：與對(duì)照小鼠肺組織相比,腫瘤組織細(xì)胞凋亡率顯著降低((P0.01)[結(jié)論]惡性表型鑒定和裸鼠成瘤表明CSC成功誘導(dǎo)BEP2D惡性轉(zhuǎn)化,A/J鼠煙熏9月發(fā)生肺癌,為下一步研究煙草致癌機(jī)制提供了理想的體內(nèi)模型第二部分Notch通路與吸煙誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的相關(guān)性[目的]采用人基因表達(dá)譜芯片方法篩選出CSC誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞差異表達(dá)基因并用Realtime PCR(qPCR)、Western blot和免疫熒光等方法驗(yàn)證；檢測(cè)A/J煙熏小鼠氣道粘膜的Notch通路分子表達(dá)；檢測(cè)重度吸煙人群氣道粘膜和肺癌組織中Notch通路分子表達(dá),分析與吸煙的相關(guān)性,明確Notch通路在吸煙誘導(dǎo)肺癌發(fā)生中的確切作用[方法]1.選取P0和P70細(xì)胞,采用Affymetrix基因表達(dá)譜芯片方法(Gene Chip prime view human)分析差異表達(dá)基因2.根據(jù)基因芯片篩選結(jié)果,運(yùn)用qPCR檢測(cè)PO、酒精組、P10、P30、P50、P70細(xì)胞中17個(gè)Notch通路主要基因：Notch1,Notch2、Notch3、Notch4、JAG1 、JAG2、DLL1,DLL3、Hes1、Hey1、Hey2、HeyL、Hes5、RBPJ、MIB2 、DNM1、Numb mRNA表達(dá)；根據(jù)Realtime qPCR結(jié)果,Western blot檢測(cè)上述各代細(xì)胞中Notch1,Notch2、JAG1、JAG2、RBPJ、Hes1、Hey1、Hey2、 DNM1、Numb蛋白表達(dá)3免疫熒光法檢測(cè)P0和P70細(xì)胞Notch1,Notch2、JAG1、Hes1、Hey1、Hey2表達(dá),觀察兩組細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)度和蛋白定位4.免疫組化法檢測(cè)煙熏前、1月、3月、9月時(shí)A/J小鼠肺組織和腫瘤中Notch1 ,Notch1 Numb表達(dá),在體動(dòng)態(tài)觀察吸煙對(duì)Notch通路的影響5.篩選20例重度吸煙和不吸煙非腫瘤患者,通過特殊光氣管鏡活檢支氣管粘膜組織,RT-PCR檢測(cè)Notch1,Notch2、JAG1、JAG2、Hes1、 Hey1、Hey2、 RBPJ、Numb mRNA表達(dá),比較上述基因表達(dá)水平與吸煙的相關(guān)性6.收集50例非小細(xì)胞肺癌手術(shù)石蠟標(biāo)本(29例吸煙,21例非吸煙),免疫組化法檢測(cè)癌組織Notch1、Notch2、Hes1、Numb表達(dá),比較上述蛋白表達(dá)水平與吸煙的相關(guān)性[結(jié)果]1.聚類分析顯示P70細(xì)胞中MAPK、P53、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的通路顯著激活,說明轉(zhuǎn)化細(xì)胞具備惡性生物學(xué)特征。同時(shí)發(fā)現(xiàn)多個(gè)Notch通路基因在P70和P0細(xì)胞存在差異表達(dá)(2倍以上差異)2.與P0和酒精組細(xì)胞相比,P70細(xì)胞Notch1、Notch2、Hes1、JAG1、Hes1、Hey1 、Hey2、RBPJ mRNA顯著上調(diào)(P均0.05)；MB2、DNM1、Numb mRNA顯著下調(diào)(P均0.05)；Notch3、Notch4、DLL1、DLL3、Hes5、HeyL和JAG2 mRNA水平在P0和P70之間無顯著性差異(P均0.05)；動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞mRNA表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)：Notch2 mRNA水平CSC誘導(dǎo)早期(P10細(xì)胞)即有顯著上調(diào),隨后略有下降,在P70細(xì)胞再次升高,多數(shù)Notch通路基因Notch1、 Hes1、JAG1、Hes1、Hey1、Hey2、RBPJ在P30細(xì)胞不同程度升高,P70表達(dá)上調(diào)最顯著3.P70細(xì)胞中Notch1、Notch2、Hes1、Hey1、Hey2、JAG1、RBPJ蛋白表達(dá)水平顯著高于P0和酒精組,Notch2在P10即出現(xiàn)早期表達(dá)顯著增高,負(fù)調(diào)控因子中Numb在P0和酒精組表達(dá)高于其余各組,P10表達(dá)顯著顯著下降,至P70細(xì)胞呈現(xiàn)乏表達(dá)狀態(tài)。各代細(xì)胞均未檢測(cè)到DNM1和JAG2表達(dá)。4 P70細(xì)胞中Notch1、Notch2胞漿的表達(dá)熒光強(qiáng)度、Hes1、Hey1、Hey2胞核的表達(dá)熒光強(qiáng)度和JAG胞膜的表達(dá)熒光強(qiáng)度顯著高于PO細(xì)胞5.Notch 1陽性細(xì)胞數(shù)在小鼠肺癌中表達(dá)最高,顯著高于煙熏前、煙熏1月、3月時(shí)肺組織的表達(dá)水平(P0.01),而對(duì)照組Notch 1表達(dá)水平無明顯變化。Notch2在腫瘤中表達(dá)最高,在腺瘤中中等強(qiáng)度表達(dá),煙熏3月肺組織中Notch2表達(dá)即明顯升高,與對(duì)照組表達(dá)水平有顯著差異(P0.01),Numb蛋白在煙熏1月肺組織中即有表達(dá)下降,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),煙熏3月時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組小鼠(P0.01)。Numb在腫瘤中表達(dá)最低,與對(duì)照組有顯著性差異(P0.01)6.重度吸煙癌前病變患者支氣管粘膜組織中Notch2、Hes1、Hey1、Hey2、JAG1、 RBPJ mRNA表達(dá)水平顯著高于不吸煙人群(P0.05),Numb mRNA水平顯著低于不吸煙人群(P0.01),Notch1和JAG2在兩組人群中表達(dá)無差異(P0.05)7.重度吸煙患者肺癌組織中Notch1、Hes1表達(dá)顯著高于非吸煙肺癌(P0.05),Numb表達(dá)顯著低于非吸煙患者(P0.05),Notch2在兩組肺癌人群中并無差異,但在吸煙腺癌中表達(dá)顯著高于非吸煙患者(P0.01),而在鱗癌中,Notch2表達(dá)與吸煙無顯著相關(guān)性(P0.05)。Notch 1無論在腺癌還是鱗癌中,吸煙患者表達(dá)水平均高于不吸煙者(P0.05),Pearson相關(guān)性分析表明：肺癌組織中Notch 1表達(dá)與Numb表達(dá)呈低度負(fù)相關(guān)(r=-0.383 P0.05),Notch2表達(dá)與Numb表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.542,P0.01)。戒煙不足1年或未戒煙者和戒煙史超過1年的肺癌患者組織中Notch1、Notch2表達(dá)無差異(P0.05)[結(jié)論]煙草激活Notch通路,并與吸煙相關(guān)肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),Notch2上調(diào)可能可能是煙草誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的早期分子事件。第三部分煙草活化Notch通路的分子機(jī)制[目的]探討Numb對(duì)Notch2表達(dá)的調(diào)控作用；通過Notch1、Notch2編碼區(qū)基因突變檢測(cè),分析吸煙對(duì)Notch編碼區(qū)突變發(fā)生頻率的影響[方法]1.免疫熒光檢測(cè)P0和P70兩組細(xì)胞中的Notch2和Numb的表達(dá)；構(gòu)建Numb過表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Numb(pIRES2-Numb),通過脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染P70細(xì)胞,激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)觀察Numb、Notch2熒光強(qiáng)度,并計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度值2.通過細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染pIRES2-Numb對(duì)P70細(xì)胞克隆形成的影響3.PCR重測(cè)序法檢測(cè)P0、P50、P70細(xì)胞和34例JNSCLC組織標(biāo)本的Notch1、Notch2編碼區(qū)基因突變,比較吸煙組和非吸煙組各個(gè)突變位點(diǎn)的發(fā)生頻率,并用免疫組化方法檢測(cè)突變頻率有差異的NSCLC組織中Hes1表達(dá)[結(jié)果]1.P70細(xì)胞中Notch2蛋白的熒光強(qiáng)度顯著高于P0,P0細(xì)胞中Numb蛋白的熒光強(qiáng)度顯著高于P70細(xì)胞。與空質(zhì)粒(pIRES2)組相比,pIRES2-Numb顯著增加了Notch2蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度值(P0.01)2.pIRES2-Numb組細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著低于pIRES2組(P0.01)3.通過Notch 1編碼區(qū)測(cè)序分析,在外顯子3、14、27和34共發(fā)現(xiàn)5種SNPs,均為同義突變：rs10521 (p.Asp1698=)、rs2229971(p.Asn755=),rs2229974(p.Asp2185=), rs3812596(p.Pro2216=), rs4489420(p.Asn104=)。吸煙NSCLC患者平均每例Notch1編碼區(qū)發(fā)生SNP的數(shù)量是3.00±1.00,高于非吸煙患者的1.13±0.83(P0.01),比較吸煙組和非吸煙組每個(gè)SNPs的發(fā)生率,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fisher精確概率法P0.05)。P70細(xì)胞Notch2編碼區(qū)檢測(cè)到7個(gè)SNPs(c.57G、c.710GA、c.5065AT、c.7042TC、c.3234CT、c.572AT和c.2882GA),頻率高于P50細(xì)胞(c.57CG、c.710GA、c.3234CT和c.572AT)和PO細(xì)胞(c.57CG和c.2622TC)4.通過Notch2編碼區(qū)測(cè)序分析,在外顯子1、4、17、18、20、28和34共檢測(cè)到9種突變序列：包括3種同義突變：rs11810554、rs61734328和rs7543643；3種錯(cuò)義突變r(jià)s146498360(p.Arg237G1n)、rs2603926 (p.Ala21Thr)和rs60854092(p.Ile1689Phe);3種新發(fā)突變：包括1種同義突變c.2622TC (p.Ile874=),2種錯(cuò)義點(diǎn)突變c.572AT(p.His191Leu), c.2882GA (P.Gly961Glu)。吸煙患者平均每例Notch2編碼區(qū)發(fā)生SNP的數(shù)量是1.32±1.16,高于非吸煙患者的0.33±0.61(P0.01),每個(gè)SNPs的發(fā)生率,在吸煙組和非吸煙者中差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；P70細(xì)胞Notch2編碼區(qū)檢測(cè)到7個(gè)SNPs(c.57CG、c.710GA、c.5065AT、c.70421C、 c.3234CT、c.572AT和c.2882GA),頻率高于P50細(xì)胞(c.57CG、 c.710GA、c.3234CT和c.572AT)和P0細(xì)胞(c.57CG和c.2622TC)5.6種突變：：p.Arg237GIn、P.Ile1689Phe、p.Leu2348=、p.His191Leu、p.Ile874=和p.Gly961Glu僅在吸煙患者中出現(xiàn),非吸煙患者未見攜帶；比較了攜帶上述六個(gè)突變的患者與其他野生型患者組織標(biāo)本中Hesl免疫組化的表達(dá)差異,結(jié)果顯示：除p.I1e874=外,其余突變中Hes1表達(dá)積分均顯著高于野生型(P0.01),表明Notch2以活化突變?yōu)橹鱗結(jié)論]Numb負(fù)調(diào)控失調(diào)和Notch編碼區(qū)突變可能是煙草誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵分子機(jī)制。第四部分Notch通路促進(jìn)人永生化支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用及其分子機(jī)制[目的]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Notch通路是否具有促進(jìn)煙草誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的作用,并比較Notchl和Notch2在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的不同作用；探討Notch通路促進(jìn)煙草誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制[方法]1.構(gòu)建慢病毒shRNA-Notch 1 (Notch 1-KD)和shRNA-Notch2(Notch2-KD)載體,并感染P70細(xì)胞,qPCR檢測(cè)干擾效率,MTT和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆的變化2. Notch1過表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Notch1 (pIRES2-Notch 1)、Notch2過表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-Notch2(pIRES2-Notch2)分別轉(zhuǎn)染P0細(xì)胞,Western blot檢測(cè)Notch1和Notch2表達(dá),MTT和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆的變化3.在Notch1-KD和Notch2-KD感染的P70細(xì)胞,分別加入凋亡誘導(dǎo)劑Etoposide,單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡4.在pIRES2-Notch1、pIRES2-Notch2轉(zhuǎn)染的P0細(xì)胞,分別加入Etoposide,單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡5.Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞XIAP、Survivin、Cleaved caspase-3、RARP表達(dá)6.采用Puromycin(嘌呤霉素)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒Notch 1-KD、Notch2-KD的細(xì)胞株,Western blot驗(yàn)證Notch1、Notch2表達(dá)下調(diào)情況；應(yīng)用上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,構(gòu)建裸鼠移植瘤模型,觀察成瘤情況、瘤體生長、免疫組化檢測(cè)Notch1、 Notch2、Ki67、XIAP、Survivin表達(dá),TUNEL法檢測(cè)瘤體組織凋亡[結(jié)果]1.Notch 1-KD敲減效率75.3%,Notch2-KD敲減效率83.6%,干擾效率較好,可以滿足后續(xù)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)要求；Notch1-KD和Notch2-KD均能顯著抑制P70細(xì)胞生長(P0.05),抑制P70細(xì)胞的克隆形成能力(P0.01),NC(空病毒組)與空白對(duì)照組相比均無顯著性差異(P0.05)。2.pIRES2-Notch1、pIRES2-Notch2轉(zhuǎn)染P0細(xì)胞72h后,與脂質(zhì)體和pIRES2組相比,Notch1、Notch2表達(dá)顯著升高(P0.01)。pIRES2-Notch2顯著增強(qiáng)P0細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞克隆形成能力(P均0.01),pIRES2-Notch1組與pIRES2、脂質(zhì)體組相比增殖能力和細(xì)胞克隆形成率均無顯著性差異(P0.05)3. Annexin V-APC法凋亡檢測(cè)顯示：Notch 1-KD和Notch2-KD不僅誘導(dǎo)細(xì)胞基礎(chǔ)凋亡量的增加(P爾0.01),并且顯著增強(qiáng)Etoposide誘導(dǎo)P70細(xì)胞的凋亡(P均0.05),Notchl-KD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率高于Notch2-KD (P0.05), NC組和對(duì)照組凋亡率無顯著差異(P0.05)4. pIRES2-Notch1、pIRES2-Notch2轉(zhuǎn)染P0細(xì)胞72h后,pIRES2-Notch2顯著抑制了Etoposide誘導(dǎo)P70細(xì)胞的凋亡(P均0.05),pIRES2-Notch1組、pIRES2、脂質(zhì)體組加入Etoposide,凋亡率顯著增高(P均0.05)5. Noch1-KD和Notch2-KD可以促進(jìn)PARP和Cleaved-caspase-3的表達(dá),加入Etoposide后PARP和Cleaved-Caspase-3蛋白上調(diào)更為顯著,Noch1-KD顯著下調(diào)Survivin表達(dá),Notch2-KD顯著下調(diào)XIAP表達(dá)6.嘌呤霉素反復(fù)篩選,成功構(gòu)建穩(wěn)定感染Notch1-KD、Notch2-KD的P70穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,經(jīng)過Western blot驗(yàn)證,目的蛋白較對(duì)照組顯著下調(diào)。將該細(xì)胞接種裸鼠�？詹《窘M成瘤率最高83%(5/6),高于Notch2-KD組50%(3/6)和Notch1-KD組33%(2/6)。免疫組化檢測(cè)瘤體Notch1、Notch2表達(dá),證實(shí)Notch 1和Notch2在KD組表達(dá)顯著低于NC組(。腫瘤生長曲線顯示,Notch1-KD組和Notch2-KD組生長速度明顯低于NC組(P0.05),Notchl-KD組生長速度、瘤體重量和Ki67表達(dá)均低于Notch2-KD組(P均0.05)；TUNEL檢測(cè)顯示,Notch1-KD組TUNEL陽性細(xì)胞的比例高于Notch2-KD(P0.05),兩組均顯著高于NC組(P0.01)。Notch1-KD組Survivin表達(dá)顯著下調(diào)(P0.01),而在Notch2-KD組XIAP表達(dá)下調(diào)較其他各組顯著(P0.01)[結(jié)論]Notch通路通過促進(jìn)XIAP、Survivin表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡,促進(jìn)CSC誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化,Notch2在惡性轉(zhuǎn)化的早期發(fā)揮主導(dǎo)作用,Notch1對(duì)后期維持轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡性表型發(fā)揮關(guān)鍵作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2057169