發(fā)布時間：2018-06-22 09:22

  本文選題：白藜蘆醇 + 復(fù)制壓力��； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：白藜蘆醇主要存在于葡萄和紅葡萄酒中,也存在于其他植物及果實中,'例如花生,蔓越橘,開心果,藍莓和越桔�，F(xiàn)在已經(jīng)有這種化合物的純化制劑和膳食補充劑。白藜蘆醇具有廣泛的益處,包括抗衰老,抗血小板聚集,抗氧化,抗炎,降血糖和抗癌。白藜蘆醇抗衰老的作用引起廣泛的關(guān)注。已有研究表明白藜蘆醇的抗氧化性和激活SIRT1的功能可能介導(dǎo)了其抗衰老的作用。從線蟲到哺乳動物,都有關(guān)于白藜蘆醇抗衰老作用的報道。但是近年來也有研究證明白藜蘆醇可以通過升高活性氧(ROS)和誘導(dǎo)DNA損傷導(dǎo)致腫瘤細胞衰老,所以白藜蘆醇在細胞水平上的促衰老或抗衰老的作用及其機制還不完全明確。關(guān)于白藜蘆醇抗氧化和促氧化的作用存在爭議。經(jīng)典的觀點認為白藜蘆醇是一個強大的抗氧化劑,由于其能減少ROS的產(chǎn)生和上調(diào)抗氧化系統(tǒng)的功能,包括還原型谷胱甘肽和超氧化物歧化酶。然而,對癌細胞的研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇還能破壞細胞抗氧化系統(tǒng),導(dǎo)致氧化壓力增加,進而抑制細胞增殖或引起細胞凋亡。另外,有研究顯示白藜蘆醇通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的早衰。我們對白藜蘆醇如何導(dǎo)致這種"氧化二元性"的機制知之甚少。另外有很多研究表明白藜蘆醇通過抑制NF-κB和NLRP3發(fā)揮抗炎的作用,預(yù)防很多疾病的發(fā)生。但是也有研究表明白藜蘆醇通過ERK,p38和Akt信號通路上調(diào)Ⅱ型膠原和COX-2表達,具有促炎的作用。白藜蘆醇是如何發(fā)揮促炎作用的及抗炎和促炎之間的決定因素還不清楚。炎癥和氧化應(yīng)激是密切相關(guān)的病理生理過程,都參與許多慢性疾病的發(fā)生。白藜蘆醇的促氧化和促炎效應(yīng)之間如何關(guān)聯(lián)也不明確。以上研究表明白藜蘆醇具有抗衰老和促衰老、抗氧化和促氧化及抗炎和促炎的作用。我們以U20S成骨肉瘤細胞為主要模型,研究了白藜蘆醇誘導(dǎo)細胞衰老的作用及機制,得到以下五部分結(jié)果:第一部分白藜蘆醇誘導(dǎo)細胞S期停滯、DNA損傷應(yīng)答及細胞的衰老許多研究表明白藜蘆醇具有抗腫瘤的作用。在本部分結(jié)果中我們檢測了白藜蘆醇對U20S細胞的毒性效應(yīng)。MTT實驗結(jié)果顯示白藜蘆能抑制U20S細胞的增殖,并具有濃度依賴性。流式細胞術(shù)檢測表明經(jīng)白藜蘆醇處理的U20S細胞,S期比例數(shù)明顯升高(S期停滯),說明存在復(fù)制壓力。我們檢測了雙鏈斷裂的標志物γ-H2AX,結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇導(dǎo)致了 DNA損傷,呈劑量依賴性。同時白藜蘆醇激活了 DNA損傷應(yīng)答的主要調(diào)控蛋白ATM,此外復(fù)制壓力的標志Chk1磷酸化也升高了。白藜蘆醇長時間處理U20S細胞能導(dǎo)致U20S細胞衰老,而且衰老的細胞依然是S期比例數(shù)較高。但是只有高濃度白藜蘆醇(≥10 μM)能誘導(dǎo)U20S細胞S期停滯和細胞衰老,低濃度的白藜蘆醇沒有這種作用。為了證明白藜蘆醇誘導(dǎo)腫瘤細胞衰老這一現(xiàn)象的普遍性,我們用不同濃度的白藜蘆醇處理人正常的成纖維細胞(NHF)和人的肺癌細胞(A549),結(jié)果和U20S細胞中的結(jié)果一致,表明白藜蘆誘導(dǎo)腫瘤細胞衰老的現(xiàn)象是普遍的。此外白藜蘆醇還能部分緩解H2O2誘導(dǎo)的U20S和NHF的衰老,說明在不同的實驗條件下白藜蘆醇誘導(dǎo)衰老或抑制衰老的作用是不同的。第二部分復(fù)制壓力和氧化壓力在白藜蘆醇誘導(dǎo)細胞衰老中的作用及相互關(guān)系白藜蘆醇被報道作為核糖核苷酸還原酶的抑制劑起作用,其比羥基脲(一種常用的復(fù)制壓力誘導(dǎo)劑)更有效地抑制小鼠核糖核苷酸還原酶的活性。第一部分的實驗結(jié)果顯示白藜蘆醇確實引起了較明顯的復(fù)制壓力。已經(jīng)有研究證明原癌基因誘導(dǎo)的細胞衰老是由復(fù)制壓力介導(dǎo)并被外源性的核苷拯救。為檢驗白藜蘆醇誘導(dǎo)的細胞衰老是否由復(fù)制壓力介導(dǎo),我們檢測了外源核苷對細胞衰老的拯救效應(yīng)。我們用核苷和白藜蘆醇共同處理U2OS細胞,結(jié)果表明核苷能減少白藜蘆醇導(dǎo)致的DNA損傷,并且5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)摻入實驗表明核苷能緩解白藜蘆醇導(dǎo)致的復(fù)制壓力。同時,核苷降低了 p-p53的蛋白水平。更重要的是核苷緩解了白藜蘆醇導(dǎo)致的U2OS細胞的衰老,而且在A549和HT1080另外兩種細胞中得到一致的結(jié)果。以上結(jié)果表明復(fù)制壓力部分介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)的腫瘤細胞衰老。有研究表明氧化壓力在白藜蘆醇誘導(dǎo)的結(jié)腸癌和內(nèi)皮細胞衰老中起很重要的作用。為了驗證氧化壓力在白藜蘆醇誘導(dǎo)的U2OS細胞衰老中的作用,用白藜蘆醇處理U2OS細胞,流式檢測ROS水平,結(jié)果白藜蘆醇明顯升高了 ROS水平。更重要的是 活性氧清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)能緩解白藜蘆醇誘導(dǎo)的細胞衰老。因此,氧化壓力也介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)的U2OS細胞的衰老。既然氧化壓力和復(fù)制壓力都能介導(dǎo)白藜蘆醇誘導(dǎo)的細胞的衰老,我們下一步研究了這兩種壓力之間的相互關(guān)系及它們介導(dǎo)細胞衰老的相對貢獻。從時間上來看,白藜蘆醇處理U2OS細胞12小時已經(jīng)出現(xiàn)了 S期停滯,而ROS水平在白藜蘆醇處理36小時才檢測到明顯的升高。此外,NAC和白藜蘆醇共處理U2OS細胞24小時并不能緩解其誘導(dǎo)的S期停滯,只有在共處理72小時的時候S期停滯才有明顯的緩解。我們在HT1080細胞中得到了類似的結(jié)果。以上實驗表明S期停滯的發(fā)生先于ROS水平的升高。之前有研究表明白藜蘆醇通過上調(diào)NADPH氧化酶NOX1/4來誘導(dǎo)人內(nèi)皮細胞的衰老。我們用NOX1/4的特異性抑制劑GKT137831(GKT)與白藜蘆醇共處理,結(jié)果GKT部分緩解了白藜蘆醇誘導(dǎo)的U2OS細胞的ROS水平的升高。RT-PCR檢測白藜蘆醇處理不同時間的NADPH氧化酶的表達水平,NOX1的mRNA水平在處理48小時明顯的升高,NOX4水平?jīng)]有升高,NOX2、NOX3、NOX5的水平在處理48小時有一定的升高。為了明確白藜蘆醇誘導(dǎo)的氧化壓力是否依賴于復(fù)制壓力,我們用血清饑餓法處理NHF細胞48小時(此時大部分細胞都處于G0/G1期),然后再用白藜蘆醇處理48小時ROS水平依然升高,表明ROS水平的升高并不依賴S期停滯或復(fù)制壓力。然而NAC能部分緩解S期停滯,表明雖然ROS的升高晚于S期停滯,但是ROS的升高加強并維持了白藜蘆醇導(dǎo)致的S期的停滯。我們也檢測了存在其他氧化壓力條件下白藜蘆醇對ROS水平的影響,發(fā)現(xiàn)經(jīng)H2O2處理的U20S細胞中,白藜蘆醇能部分降低H2O2導(dǎo)致的ROS水平的升高。在NHF細胞中的到了類似的結(jié)果,表明白藜蘆醇發(fā)揮促氧化或抗氧化作用取決于實驗條件。第三部分P53依賴的CXCR2上調(diào)介導(dǎo)細胞衰老并且具有抗凋亡的作用我們之前的研究證明p53-CXCR2通路在壓力誘導(dǎo)的NHF細胞和U20S細胞衰老中起重要作用。因此我們猜想CXCR2上調(diào)也可能介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)U20S細胞的衰老。經(jīng)白藜蘆醇處理的U20S細胞,CXCR2表達明顯升高,并具有濃度依賴性和時間依賴性。但是CXCR2水平的升高在第五天達到高峰隨后又下降,p21和CXCR2有類似的趨勢,說明衰老一旦形成只需要少量的效應(yīng)蛋白維持即可。另外白藜蘆醇能緩解H2O2導(dǎo)致的CXCR2水平的升高。CXCR2的表達上調(diào)依賴p53;敲除CXCR2后白藜蘆醇誘導(dǎo)的U20S細胞的衰老明顯得到了緩解。以上結(jié)果表明p53-CXCR2通路在白藜蘆醇誘導(dǎo)的細胞衰老中起到重要作用。我們發(fā)現(xiàn)敲低CXCR2后白藜蘆醇處理組與對照相比凋亡比例明顯增加,抗凋亡蛋白BCL-2水平也部分下調(diào)。當CXCR2被敲低以后,H2O2誘導(dǎo)的U20S細胞和NHF細胞的凋亡比例也明顯增加。以上結(jié)果表明CXCR2具有促衰老抗凋亡的作用。第四部分NF-kB激活發(fā)揮抗凋亡促衰老作用之前有很多研究表明白藜蘆醇通過抑制NF-κB和NLRP3的活性發(fā)揮抗炎作用減少體內(nèi)炎癥反應(yīng)。但是也有研究顯示白藜蘆醇可通過ERK,p38和Akt信號通路上調(diào)Ⅱ型膠原和COX-2表達,發(fā)揮促炎的作用。我們發(fā)現(xiàn)5OμM白藜蘆醇可以升高U20S細胞內(nèi)IL-6、IL-8 IL-1β和COX-2mRNA水平,說明白藜蘆醇可以導(dǎo)致U20S細胞內(nèi)炎癥水平升高。我們還發(fā)現(xiàn)NAC可以緩解白藜蘆醇導(dǎo)致的U20S細胞內(nèi)IL-8和IL-1β mRNA水平升高,說明氧化壓力介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)炎癥的產(chǎn)生。另外白藜蘆醇可以誘導(dǎo)p-p65蛋白水平升高,NF-κB抑制劑可以部分緩解白藜蘆醇導(dǎo)致的炎癥因子水平的升高,說明白藜蘆醇誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生部分是通過NF-κB通路介導(dǎo)的。更重要的是NF-κB被抑制后凋亡比例數(shù)明顯的增加,說明NF-κB在白藜蘆醇誘導(dǎo)的細胞衰老過程中發(fā)揮抗凋亡的作用。另外白藜蘆醇可以激活NF-κB,NF-κB抑制劑可以部分緩解白藜蘆醇導(dǎo)致的炎癥因子水平的升高。我們還研究了 NF-κB的抗凋亡作用,發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理后BCL2等抗凋亡因子的表達上調(diào)被NF-κB抑制劑抑制,說明白藜蘆醇通可能過激活NF-κB 發(fā)揮抗凋亡和促衰老作用。
[Abstract]:resveratrol mainly exists in grapes and red wine , and also exists in other plants and fruits , The effects of resveratrol on anti - aging , anti - inflammatory , anti - inflammatory , anti - inflammatory , anti - inflammatory and anti - inflammatory effects of resveratrol have been studied . In order to study the effect of resveratrol on the senescence of human endothelial cells induced by resveratrol . The anti - apoptotic effect of NF - 魏B and NF - 魏B can be partially alleviated by the activation of NF - 魏B and NF - 魏B inhibitor . The anti - apoptotic effect of NF - 魏B was also investigated . It was found that the expression of anti - apoptotic factors , such as BCL2 after resveratrol treatment , was inhibited by NF - 魏B inhibitor , suggesting that resveratrol could activate NF - 魏B to play an anti - apoptosis and anti - aging effect .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5

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1 李波漩;白藜蘆醇依次誘導(dǎo)復(fù)制壓力和氧化壓力驅(qū)動p53-CXCR2通路介導(dǎo)的腫瘤細胞衰老[D];山東大學(xué);2017年

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本文編號：2052367