本文選題：乳腺癌 + 輻射抵抗��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景及目的：乳腺癌是威脅著全球女性的健康的常見(jiàn)惡性腫瘤。放射治療在乳腺癌的治療中占據(jù)著重要地位,是使用廣泛,臨床獲益顯著的治療手段,可以降低乳腺癌局部腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和死亡率。然而,由于新生血管形成速度和惡性腫瘤細(xì)胞增殖速度的不平衡,大部分實(shí)體瘤內(nèi)部都存在一定的乏氧區(qū)域,存在于乏氧區(qū)域的腫瘤細(xì)胞一般被稱作乏氧腫瘤細(xì)胞,這些細(xì)胞常有顯著的輻射抵抗性。難以被徹底清除的乏氧腫瘤細(xì)胞,常常是造成實(shí)體瘤晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要原因。局部乏氧的微環(huán)境是實(shí)體瘤的重要特征之一,然而在正常組織中卻罕見(jiàn)乏氧區(qū)域。因此特異性地增加乏氧腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性是一個(gè)提高乳腺癌的放射治療效果的理想途徑。p53是一個(gè)常見(jiàn)的抑癌基因,對(duì)腫瘤細(xì)胞的放射敏感性起著重要的調(diào)節(jié)作用,在多種惡性腫瘤中,p53的功能缺失會(huì)引發(fā)對(duì)輻射的抵抗。有研究報(bào)導(dǎo),在乏氧的情況下,野生型p53的腫瘤細(xì)胞比敲除p53基因的腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射更敏感,因此乏氧微環(huán)境中p53缺失的腫瘤細(xì)胞更易存活。而且在某些腫瘤細(xì)胞系中,乏氧處理會(huì)抑制p53的功能,從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性減弱,而再激活p53則可以增加乏氧腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。由于乏氧區(qū)域很少出現(xiàn)在正常組織當(dāng)中,因此可以靶向乏氧腫瘤細(xì)胞的p53融合蛋白可能是一種新穎有效的輻射增敏劑。線粒體自噬,是線粒體上發(fā)生的一類自噬作用,是細(xì)胞在某些刺激因素(如低氧、饑餓、氧化應(yīng)激等)刺激下,細(xì)胞中損傷和老化的線粒體被自噬小體特異性吞噬,并被溶酶體降解的過(guò)程。Parkin蛋白是線粒體自噬過(guò)程中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子, Parkin蛋白被特異性地募集到膜電位低的受損線粒體上,并進(jìn)一步介導(dǎo)受損線粒體被自噬小體吞噬降解。最近有研究發(fā)現(xiàn)乏氧可以誘導(dǎo)Parkin蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬,降解受損的線粒體,從而維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。而過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)自噬參與腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射產(chǎn)生抵抗的過(guò)程,因此,我們推測(cè)Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬可能參與了乏氧細(xì)胞的輻射抵抗反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)p53既可以在核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)自噬,也可以通過(guò)核外非轉(zhuǎn)錄途徑對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)節(jié),而這一途徑的作用機(jī)制尚研究甚少。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn),在正常組織細(xì)胞中,p53可以抑制線粒體自噬,在鼠的心肌和胰腺β細(xì)胞中,胞質(zhì)p53可以通過(guò)與Parkin蛋白結(jié)合阻斷線粒體自噬的進(jìn)程。然而在腫瘤細(xì)胞中p53如何調(diào)節(jié)線粒體自噬還未有研究。在我們的前期研究中,我們構(gòu)建了一個(gè)新型融合蛋白載體,TAT-ODD-p53,包含人野生型p53蛋白、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域多肽(TAT47_57),以及缺氧靶向穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)域多肽(ODD557-574),并成功地進(jìn)行了蛋白的表達(dá)和純化。同時(shí),我們也合成了其對(duì)照蛋白：p53, TAT-p53和TAT-ODD-EGFP。TAT-ODD-p53可以通過(guò)TAT多肽區(qū)域的作用成功進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,同時(shí),在ODD多肽區(qū)域的作用下選擇性地在乏氧腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定存在。我們?cè)隗w外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了TAT-ODD-p53在乏氧條件下對(duì)乳腺癌細(xì)胞的靶向輻射增敏作用,并闡明其作用機(jī)制。我們的研究發(fā)現(xiàn),TAT-ODD-p53可以靶向乏氧的乳腺癌細(xì)胞,并通過(guò)阻斷Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬以增加其輻射敏感性。方法：1.體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證融合蛋白TAT-ODD-p53在不同氧濃度的乳腺癌細(xì)胞中的穩(wěn)定性1.1乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(p53野生型),和人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-157(p53缺失型)用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。1.2融合蛋白合成構(gòu)建TAT-ODD-p53, TAT-p53,p53 and TAT-ODD-EGFP的質(zhì)粒。通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)和純化獲得相應(yīng)的融合蛋白,獲得的融合蛋白溶解于50 mM PBS中,在-80℃保存六個(gè)月內(nèi)使用。1.3細(xì)胞乏氧處理使用Forma 1029厭氧培養(yǎng)箱,在37℃、0.5%O2和5%CO2的條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行乏氧處理。并且在使用融合蛋白或輻照處理前,細(xì)胞需在乏氧條件下培養(yǎng)8小時(shí)。1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)提取待檢測(cè)細(xì)胞的總蛋白,采用BCA法來(lái)測(cè)定相應(yīng)蛋白濃度,接著進(jìn)行蛋白變性反應(yīng),然后使用準(zhǔn)備好的蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉步驟,并孵育相應(yīng)的一抗和二抗,最后在顯影儀上采用ECL法進(jìn)行顯影。1.5荷瘤鼠模型將MDA-MB-157細(xì)胞用無(wú)菌生理鹽水重懸制成細(xì)胞懸液,將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×107個(gè)/ml。選擇6-8周齡的正常雌性Balb/c裸鼠,將接1x107個(gè)細(xì)胞接種在裸鼠右側(cè)乳房脂肪墊下。為了觀察p53融合蛋白的穩(wěn)定性和分布情況,當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至200 mm3左右時(shí),將1 mg/kg的p53融合蛋白進(jìn)行裸鼠腹腔注射,每天一次連續(xù)注射5天后取瘤體標(biāo)本進(jìn)行觀察,在裸鼠處死前1h腹腔注射pimonidazole (60 mg/kg)以標(biāo)記腫瘤內(nèi)的乏氧區(qū)域。1.6組織免疫熒光將所取腫瘤組織放在使用干冰預(yù)冷后錫箔紙上,待組織冷凍以后放置于-80℃凍存。取凍存組織制備冰凍切片,依據(jù)乏氧探針試劑盒(HypoxyprobeTM-1 Kit)說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行熒光染色,同時(shí)進(jìn)行p53蛋白熒光染色,切片用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。2.體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TAT-ODD-p53融合蛋白對(duì)乏氧乳腺癌細(xì)胞的輻射增敏作用2.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)使用MTT比色法,測(cè)定通過(guò)p53融合蛋白對(duì)MCF-7和MDA-MB-157乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性,以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用的蛋白濃度的參考。消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的乳腺癌細(xì)胞,制成單細(xì)胞的懸浮液后,均勻接種在96孔板中并培養(yǎng)過(guò)夜。第二天分別在常氧和乏氧條件下加入梯度濃度(0,2,4,8,16,32 μg/ml)的融合蛋白孵育72 h,接著在每孔中加入5mg/mL的MTT,充分混勻并繼續(xù)孵育4h,在棄掉上清液之后向每孔中加入150ul二甲基亞砜,最后使用酶標(biāo)儀來(lái)檢測(cè)吸光值(A570nm)。2.2克隆形成實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞消化制成單細(xì)胞懸液,按0、2、4、6、8五個(gè)劑量組照接種相應(yīng)數(shù)量的乳腺癌細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜。使用6-MV的X射線對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行照射后,繼續(xù)培養(yǎng)10-14天,直到培養(yǎng)出肉眼可以見(jiàn)的克隆,將細(xì)胞用甲醇固定后,加入1%的結(jié)晶紫乙醇溶液進(jìn)行細(xì)胞染色,使用顯微鏡計(jì)算克隆(含有50個(gè)細(xì)胞以上)數(shù)目。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),計(jì)算克隆形成率和存活分?jǐn)?shù),依據(jù)多靶單擊進(jìn)行生存曲線擬合,并通過(guò)模型計(jì)算輻射增敏比值SER和氧增強(qiáng)比值OER。2.3流式細(xì)胞檢測(cè)分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡在6孔板中接種5×105個(gè)／孔密度的細(xì)胞,鏡下觀察細(xì)胞的匯合度達(dá)到大約80%左右時(shí)進(jìn)行處理。細(xì)胞照射繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收集細(xì)胞檢測(cè)凋亡。采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞雙染法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光染色,并使用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)相應(yīng)的熒光標(biāo)記。3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TAT-ODD-p53融合蛋白的輻射增敏作用3.1腫瘤生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至200mm3左右時(shí),將1mg/kg的p53融合蛋白進(jìn)行裸鼠腹腔注射,每天注射一次,連續(xù)處理5天,最后一次注射后進(jìn)行單次劑量10 Gy的照射。使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小,每3天測(cè)量一次,腫瘤體積依據(jù)公式V=(axb2)/2來(lái)進(jìn)行計(jì)算,a和b分別代表最長(zhǎng)徑和最短徑。3.2 TUNEL法檢測(cè)組織凋亡在裸鼠照射后7天取腫瘤組織進(jìn)行冰凍切片,根據(jù)In Situ Cell Death DetectionKit試劑盒的操作說(shuō)明,通過(guò)原位末端標(biāo)記(’TUNEL)法檢測(cè)各組織標(biāo)本中的凋亡情況,用DAPI熒光試劑復(fù)染細(xì)胞核后,使用熒光顯微鏡來(lái)觀察并計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)。4. TAT-ODD-p53融合蛋白對(duì)乏氧乳腺癌細(xì)胞輻射增敏作用機(jī)制的研究4.1構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的MDA-MB-157細(xì)胞在6孔板中接種密度5×105個(gè)／孔的MDA-MB-157細(xì)胞,待細(xì)胞達(dá)到40%左右密度時(shí),分別加入MAP1LC3B以及陰性對(duì)照LV5-NC慢病毒懸液(MOI=20),同時(shí)選擇2孔加入polybrene (6ug/ml)以增加感染效率,培養(yǎng)24h后更換細(xì)胞培養(yǎng)基,再繼續(xù)培養(yǎng)72h,使用熒光顯微鏡拍照并計(jì)算細(xì)胞感染效率。接著通過(guò)流式細(xì)胞儀將GFP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞分選出來(lái),從而得到GFP陽(yáng)性比例較高的細(xì)胞,并繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng),最終得到可以穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的乳腺癌細(xì)胞。4.2 siRNA和plasmid的轉(zhuǎn)染依據(jù)lipofectamine 2000試劑的操作說(shuō)明,使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,細(xì)胞接種后用無(wú)血清培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞,當(dāng)接種細(xì)胞的融合度達(dá)到70%左右時(shí),將siRNA或者plasmid用轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基Opti-MEMI Reduced Serum Medium稀釋,同樣的,將lipofectamine 2000用轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基Opti-MEMI Reduced Serum Medium稀釋后,與siRNA或者plasmid的稀釋溶液充分混合后,在室溫下條件靜置20min,將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)板中小心混勻。將處理后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后,可置換培養(yǎng)基為含血清培養(yǎng)基,再將細(xì)胞繼續(xù)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.3免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)將5×104個(gè)穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的MDA-MB-157細(xì)胞接種在共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜,然后將細(xì)胞分別置于常氧(20%02)和乏氧(0.5%O2)條件下培養(yǎng)8h,接著對(duì)細(xì)胞進(jìn)行6 Gy劑量的照射,然后繼續(xù)培養(yǎng)6h,用4%的多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定,加入200 nM的MitoTracker Red對(duì)線粒體進(jìn)行染色,并用DAPI熒光試劑復(fù)染細(xì)胞核,最后使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行掃描和觀察。4.4透射電鏡實(shí)驗(yàn)將5×105個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過(guò)夜,然后將細(xì)胞在乏氧條件下培養(yǎng)8h,細(xì)胞接受6 Gy的照射6h后,立即置于含2%的多聚甲醛和2.5%的戊二醛固定液中進(jìn)行固定。使用振動(dòng)切片機(jī)制作50μm厚度的切片,用1%的四氧化鋨孵育切片1h進(jìn)行后固定,通過(guò)乙醇梯度脫水后將切片嵌入環(huán)氧樹(shù)脂中。80℃孵育24 h完成聚合反應(yīng),最終制成100 nm的超薄切片,使用透射電鏡進(jìn)行觀察。4.5 mtDNA分析實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)Universal Genomic DNA Extraction Kit說(shuō)明書(shū)步驟獲得基因組DNA,接著使用SYBR(?) Premix Ex TaqTM kit試劑盒,依據(jù)試劑盒操作步驟來(lái)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。基因表達(dá)水平通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法校正,計(jì)算nt-Atp6/Rp113相對(duì)表達(dá)量。4.6 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)首先使用rizol Reagent試劑獲得細(xì)胞總RNA,然后依據(jù)PrimeScript (?) RT reagent kit操作步驟來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得實(shí)驗(yàn)所需的cDNA;以上一步實(shí)驗(yàn)獲得的cDNA為模板,使用SYBR(?) Premix Ex TaqTM kit試劑盒,依據(jù)試劑盒操作步驟來(lái)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),以檢測(cè)目的mRNA的表達(dá)水平。4.7免疫共沉淀使用PARIS kit提取胞質(zhì)蛋白,接著采用Pierce Co-Immunoprecipitation Kit;進(jìn)行免疫共沉淀反應(yīng),將裂解液與含有10 μg一抗的共價(jià)交聯(lián)樹(shù)脂置于4℃孵育過(guò)夜,共沉淀產(chǎn)物洗脫后進(jìn)行Western blot分析。5.統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示,組間采用兩樣本t檢驗(yàn)(Independent-Sample t-test)進(jìn)行比較。P值0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.體外實(shí)驗(yàn)證明TAT-ODD-p53特異穩(wěn)定存在于乏氧乳腺癌細(xì)胞中用pbs或10μg/mlp53融合蛋白處理p53缺失型乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-157,分別在常氧(20%02)和乏氧(0.5%02)條件下孵育8h后,用Western blotting檢測(cè)p53蛋白表達(dá)水平。只有TAT-p53或TAT-ODD-p53融合蛋白處理的細(xì)胞中有p53蛋白表達(dá),說(shuō)明p53融合蛋白是通過(guò)TAT結(jié)構(gòu)域成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞。TAT-p53處理的細(xì)胞中p53蛋白在常氧和乏氧條件下都有表達(dá),而只有TAT-ODD-p53可以特異性的在乏氧乳腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定存在,而在常氧乳腺癌細(xì)胞中快速降解。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明TAT-ODD-p53特異穩(wěn)定存在于乳腺癌乏氧區(qū)域使用免疫熒光共定位的方法分析荷瘤小鼠模型中TAT-ODD-p53與乏氧標(biāo)記pimonidazole的表達(dá),發(fā)現(xiàn)TAT-ODD-p53的表達(dá)與乏氧探針pimonidazole的表達(dá)區(qū)域具有一致性,說(shuō)明TAT-ODD-p53可以特異性的穩(wěn)定存在于乳腺癌腫瘤組織中的乏氧區(qū)域。3.檢測(cè)TAT-ODD-p53的IC50值為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的蛋白濃度,我們?cè)诓煌鯘舛葪l件下,使用梯度濃度的TAT-ODD-p53蛋白處理乳腺癌細(xì)胞,通過(guò)MTT法檢測(cè)TAT-ODD-p53蛋白的細(xì)胞毒性作用,并計(jì)算其IC50值。TAT-ODD-p53只有在乏氧條件下有顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用,而p53缺失型乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-157與p53野生型乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞的ICso值分別為4.00 μg/ml和12.85 μg/ml。4. TAT-ODD-p53對(duì)乏氧乳腺癌細(xì)胞的輻射增敏作用不同氧濃度條件下,通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得到MCF7與MDA-MB-157細(xì)胞的氧增強(qiáng)比(OER)分別為1.91和2.43,說(shuō)明乏氧條件下乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的輻射抵抗。而乏氧條件下MCF7與MDA-MB-157細(xì)胞在4.00 μg/ml的TAT-ODD-p53處理1小時(shí)后的放射增敏比(SER)分別為1.55 and 2.24,表明TAT-ODD-p53提高了乏氧乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性,減輕了乏氧條件下乳腺癌細(xì)胞的輻射抵抗。同時(shí)通過(guò)流式分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)和western blot檢測(cè)TAT-ODD-p53處理乏氧乳腺癌MDA-MB-157細(xì)胞后凋亡明顯增加,這也證實(shí)了TAT-ODD-p53對(duì)乏氧乳腺癌細(xì)胞的輻射增敏作用。5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明TAT-ODD-p53對(duì)乏氧乳腺癌細(xì)胞的輻射增敏作用建立MDA-MB-157移植瘤小鼠模型,使用PBS或TAT-ODD-p53 (1 mg/kg)處理后進(jìn)行單次劑量10Gy的X線照射,觀察瘤體長(zhǎng)到預(yù)期最大體積(600 mm3).的時(shí)間。在未照射組,使用PBS或TAT-ODD-p53處理后瘤體生長(zhǎng)時(shí)間分別為14和18天,在照射組二者分別為21和32天。說(shuō)明TAT-ODD-p53聯(lián)合照射組的瘤體生長(zhǎng)速度顯著減緩。而TAT-ODD-EGFP對(duì)裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)并沒(méi)有抑制作用也沒(méi)有提高腫瘤的放射敏感性,說(shuō)明TAT-ODD本身并沒(méi)有抗腫瘤作用。同樣的,通過(guò)TUNEL法檢測(cè)瘤體組織的凋亡情況,發(fā)現(xiàn)在TAT-ODD-p53聯(lián)合照射組的凋亡率明顯增加。6.乏氧條件下乳腺癌細(xì)胞中線粒體自噬增加線粒體通過(guò)自噬作用被清除的這一個(gè)過(guò)程稱作線粒體自噬,是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要步驟。通過(guò)自噬標(biāo)記蛋白LC3與線粒體標(biāo)記物MitoTracker的熒光共定位可以用來(lái)評(píng)估線粒體自噬。在乏氧條件下,穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的MDA-MB-157細(xì)胞中的熒光共定位數(shù)明顯增加。同時(shí),透射電鏡也可以觀察到,在乏氧條件下,MDA-MB-157細(xì)胞內(nèi)被自噬小體包裹的線粒體數(shù)量增加。這些結(jié)果表明乏氧可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞線粒體自噬的發(fā)生,并在受照射后持續(xù)存在。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論,我們通過(guò)real time PCR檢測(cè)了以基因組DNA Rp113作為內(nèi)參的線粒體DNA (mtDNA)標(biāo)志物mt-Atp6的相對(duì)表達(dá)量,這一數(shù)據(jù)可以反映細(xì)胞內(nèi)線粒體含量。結(jié)果表明,mtDNA含量在乏氧的受照射細(xì)胞中明顯減少,并且在干擾了自噬相關(guān)蛋白Atg7阻斷自噬過(guò)程后不再出現(xiàn)mtDNA含量的顯著減少。提示在乏氧條件下,線粒體可以通過(guò)線粒體自噬過(guò)程被清除。7. TAT-ODD-p53可以通過(guò)抑制乏氧誘導(dǎo)的線粒體自噬增加乳腺癌細(xì)胞放射敏感性在加入TAT-ODD-p53干預(yù)后,乏氧條件下MDA-MB-157細(xì)胞中熒光共定位數(shù)量減少,并且mtDNA含量增加。而在p53野生型乳腺癌MCF7細(xì)胞中,干擾p53的表達(dá)可以明顯增加乏氧條件下熒光共定位數(shù)量,并且mtDNA含量減少,這些結(jié)果說(shuō)明TAT-ODD-p53可以抑制乏氧條件下乳腺癌細(xì)胞線粒體自噬的發(fā)生�？寺⌒纬蓪�(shí)驗(yàn)顯示,干擾Atg7阻斷線粒體自噬進(jìn)程后,MDA-MB- 157細(xì)胞的SER為1.93,放射敏感性增加。而TAT-ODD-p53 處理組乏氧 MDA-MB-157細(xì)胞的SER值在Atg7被干擾后由2.26下降到1.27,說(shuō)明TAT-ODD-p53的增敏作用在線粒體自噬過(guò)程被阻斷后明顯減弱,提示TAT-ODD-p53對(duì)乏氧乳腺癌細(xì)胞的增敏作用至少有一部分是通過(guò)抑制線粒體自噬來(lái)產(chǎn)生。8. TAT-ODD-p53可以通過(guò)Parkin通路抑制線粒體自噬在乏氧MDA-MB-157細(xì)胞中干擾Parkin表達(dá)后,線粒體自噬的熒光共定位數(shù)量減少,同時(shí)mtDNA含量增加,說(shuō)明被線粒體自噬的清除作用減弱。提示乏氧條件下誘發(fā)了Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬。過(guò)表達(dá)Parkin可以減弱TAT-ODD-p53對(duì)乏氧MDA-MB-157細(xì)胞線粒體自噬的抑制作用,線粒體含量相應(yīng)的有所增加。在乏氧MCF7 ceils干擾p53后線粒體自噬顯著增加,而敲除Parkin后p53敲除對(duì)線粒體自噬的誘導(dǎo)也顯著減弱。說(shuō)明在乏氧條件下TAT-ODD-p53可以通過(guò)Parkin通路抑制線粒體自噬的發(fā)生。9. TAT-ODD-p53可以在胞質(zhì)中與Parkin結(jié)合抑制其線粒體轉(zhuǎn)位qRT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)顯示p53并沒(méi)有影響Parkin的表達(dá)水平,而是減少了乏氧乳腺癌細(xì)胞中Parkin定位在線粒體上的含量。在TAT-ODD-p53處理后,乏氧MDA-MB-157細(xì)胞線粒體上Parkin的蛋白含量明顯減少。而在干擾p53后,乏氧MCF7細(xì)胞線粒體上Parkin的蛋白含量明顯增加。并且TAT-ODD片段本身并不能改變Parkin的定位情況。進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在TAT-ODD-p53處理的乏氧MDA-MB- 157細(xì)胞以及p53野生型的MCF7細(xì)胞中,p53和Parkin蛋白都可以直接結(jié)合。10. Parkin蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬參與TAT-ODD-p53對(duì)乏氧乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感作用在過(guò)表達(dá)Parkin蛋白后,TAT-ODD-p53對(duì)乏氧乳腺癌細(xì)胞MDA-MB- 157的輻射增敏作用明顯減弱。而在敲除ATG7抑制線粒體自噬進(jìn)程后,再過(guò)表達(dá)Parkin蛋白便不再有增加輻射抵抗的作用。這些結(jié)果提示TAT-ODD-p53對(duì)乏氧乳腺癌細(xì)胞輻射增敏作用至少有一部分是通過(guò)抑制Parkin蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬來(lái)實(shí)現(xiàn)。結(jié)論：1.體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明TAT-ODD-p53特異穩(wěn)定存在于乏氧乳腺癌細(xì)胞中。2.體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明TAT-ODD-p53可增加乏氧乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。3.TAT-ODD-p53通過(guò)抑制線粒體自噬從而增加乏氧乳腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。4.TAT-ODD-p53通過(guò)結(jié)合Parkin蛋白阻斷其線粒體轉(zhuǎn)位從而抑制乏氧誘導(dǎo)的線粒體自噬。5.TAT-ODD-p53可以通過(guò)抑制Parkin蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬而增加乏氧乳腺癌細(xì)胞輻射敏感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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