本文選題：NLS-RARα + RARα　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：第一部分?jǐn)y帶RARa基因的重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對人白血病細(xì)胞的影響目的：用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建人RARa基因重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒,感染人白血病細(xì)胞株NB4后用一定濃度的全反式維甲酸ATRA誘導(dǎo),觀察其對白血病細(xì)胞株增殖、分化和凋亡的影響,同時與變異型NLS-RARa的細(xì)胞生物學(xué)功能相比較,觀察二者的生物學(xué)功能差異。方法：以白血病細(xì)胞株NB4的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增RARa基因,克隆至穿梭質(zhì)粒pAdTrace-TO4中,構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrace-T04-RARα。用限制性內(nèi)切酶EcoR V和SalⅠ雙酶切及測序鑒定,然后轉(zhuǎn)化含有骨架質(zhì)粒AdEasy-1的大腸桿菌BJ5183菌株的感受態(tài),同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒Ad-RARα。酶切驗證后,限制性內(nèi)切酶Pac Ⅰ酶線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,包裝出重組腺病毒Ad-RARα,經(jīng)3輪擴(kuò)增后,測定病毒滴度,進(jìn)行PCR鑒定。流式細(xì)胞術(shù)測定病毒感染效率,Western blot法檢測重組腺病毒感染的人NB4細(xì)胞中RARa蛋白,CCK-8法檢測重組腺病毒感染對NB4細(xì)胞增殖的影響,Annexin V/PI雙染法測定細(xì)胞周期,PI測定細(xì)胞凋亡,Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果：重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrace-T04-RARa構(gòu)建成功,病毒感染效率可達(dá)70%,與對照組的NB4細(xì)胞相比,重組腺病毒感染的NB4細(xì)胞內(nèi)RARa蛋白的表達(dá)明顯升高(P0.05),且經(jīng)一定濃度全反式維甲酸ATRA處理后,能夠有效地促進(jìn)感染重組腺病毒細(xì)胞的分化成熟和凋亡,變異蛋白NLS-RARa與之相比,NLS-RARa亦能促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖,抑制分化。結(jié)論：變異蛋白NLS-RARa與野生型RARa在白血病細(xì)胞株中過表達(dá)后均能促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞分化,在經(jīng)一定濃度的維甲酸誘導(dǎo)后均能促進(jìn)細(xì)胞分化成熟和凋亡,故得出結(jié)論：變異蛋白NLS-RARa與野生型RARa的細(xì)胞生物學(xué)功能相似,NLS-RARa可能通過與野生型RARa類似的功能影響白血病細(xì)胞株的細(xì)胞生物學(xué)功能。第二部分RARa和NLS-RARa的結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究目的：通過研究NLS-RARa的結(jié)合位點(diǎn),與RARa的結(jié)合位點(diǎn)相比較,證明NLS-RARa為一個變異的轉(zhuǎn)錄因子,可能與RARa競爭性結(jié)合某些基因而參與到APL的發(fā)生中。方法：構(gòu)建維甲酸受體α (RARa)、視黃醛受體α (RXRa)及變異蛋白NLS-RARa的真核表達(dá)質(zhì)粒,通過間接免疫熒光(IFF)觀察RARα、RXRa和NLS-RARa的核漿分布,然后用免疫共沉淀(Co-IP)分別檢測RARα、NLS-RARa同RXRa是否有相互作用；凝膠電泳遷移率實(shí)驗(EMSA)檢測RARα、NLS-RARa結(jié)合維甲酸反應(yīng)元件DNA探針的能力；最后用熒光素酶報告實(shí)驗檢測RARa和NLS-RARa調(diào)控維甲酸反應(yīng)元件活性的程度。結(jié)果：維甲酸受體α (RARa)、視黃醛受體α (RXRa)的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；間接免疫熒光結(jié)果顯示,與RARa相比,NLS-RARa更多地分布在細(xì)胞核內(nèi)；免疫共沉淀和Native-PAGE結(jié)果顯示NLS-RARa與RXRa有相互作用,并能夠形成二聚體；凝膠電泳遷移率實(shí)驗和熒光素酶報告實(shí)驗證明NLS-RARa能夠結(jié)合維甲酸反應(yīng)元件DNA探針及調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)論：該研究成功地構(gòu)建了RARα、RXRa的真核表達(dá)質(zhì)粒,并證明NLS-RARa有轉(zhuǎn)錄活性,NLS-RARa可能作為一個變異的轉(zhuǎn)錄因子參與影響白血病細(xì)胞株的增殖、分化等生物學(xué)功能,為豐富APL發(fā)生機(jī)制信號網(wǎng)絡(luò)的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。
[Abstract]:The recombinant adenovirus expression plasmid pAdTrace - T04 - RARa was cloned into shuttle plasmid pAdTrace - TO4 . The recombinant adenovirus Ad - RARa was cloned into shuttle plasmid pAdTrace - TO4 . Methods : The eukaryotic expression plasmids of retinoic acid receptor 偽 ( RARa ) , retinoic acid receptor 偽 ( RXRa ) and variant protein - RARa were constructed by indirect immunofluorescence ( IFF ) .
gel electrophoresis mobility assay ( EMSA ) was used to detect the ability of RAR偽 , ~ RARa to bind to the DNA probe of the retinoic acid reaction element ;
The results showed that the eukaryotic expression plasmid of retinoic acid receptor 偽 ( RARa ) and retinoic acid receptor 偽 ( RXRa ) was successfully constructed .
Indirect immunofluorescence results showed that , in contrast to RARa , there was a greater distribution in the nucleus than RARa .
The results of immuno - co - precipitation and Native - PAGE showed the interaction with RXRa and the formation of dimers .
Conclusion : The study successfully constructed the eukaryotic expression plasmid of RAR偽and RXRa , and proved that the transcription activity and the transcription activity of the nuclear fusion protein were confirmed by this study .
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7

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本文編號：2024185