本文選題：SNP檢測 + 方法學(xué)　； 參考：《華東理工大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：當(dāng)前,檢測基因SNP已成為分析判斷遺傳病、個(gè)體化藥物反應(yīng)特征的重要手段,也是預(yù)測和預(yù)防許多疾病的重要手段�，F(xiàn)今的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)檢測方法,比如測序法和Taq探針法都存在一定的弊端。因此我們開發(fā)了一種高效的基于熒光淬滅的SNP檢測方法——Quenching-PCR法。該方法是利用標(biāo)記有熒光淬滅分子的特異序列探針與有熒光分子標(biāo)記的雙脫氧核苷三磷酸在待測基因的特異位點(diǎn)上進(jìn)行單堿基延伸,然后通過檢測在探針末端延伸的熒光分子標(biāo)記的堿基的熒光淬滅值,來確定探針末端延伸的堿基類型,亦即待測基因特異位點(diǎn)的堿基類型。與金標(biāo)準(zhǔn)測序法相比,Quenching-PCR法結(jié)果的一致率為93.40%,TaqMan探針法結(jié)果的一致率為92.45%,由此可見,Quenching-PCR法與TaqMan探針法在準(zhǔn)確度方面無明顯差異。但在檢測成本、檢測時(shí)間和探針設(shè)計(jì)等方面都遠(yuǎn)優(yōu)于TaqMan探針法,因此Quenching-PCR法更易于在臨床診斷中應(yīng)用,具有重要意義。在建立的基于熒光淬滅的SNP檢測方法的基礎(chǔ)上,我們將該方法用于臨床相關(guān)腫瘤個(gè)體化用藥常規(guī)位點(diǎn)的檢測。選取與酪氨酸激酶抑制劑作用靶點(diǎn)——表皮生長因子受體基因(epidermal growth factor receptor, EGFR)相關(guān)位點(diǎn)的檢測, EGFR第19號外顯子中的2235_2249位的插入缺失和第21號外顯子的L858R與藥物效應(yīng)密切相關(guān)；同時(shí)還用于與鉑類藥物使用相關(guān)的多藥耐藥相關(guān)蛋白2基因(Multidrug resistance-associated protein 2, MRP2) Val417Ile位點(diǎn)、核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基團(tuán)1(Excision repair cross-complementation group 1, ERCC1)rs3212986位點(diǎn)和X線修復(fù)交叉互補(bǔ)基團(tuán)1基因(X-rayrepaircrosscomplementing 1, XRCC1) Arg 194T rp位點(diǎn)的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Quenching PCR能很好用于腫瘤個(gè)體化用藥相關(guān)位點(diǎn)SNP的檢測,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該方法不但能用于SNP的檢測,還能應(yīng)用于插入／缺失(Insert/Delete, InDel)的檢測。腫瘤異質(zhì)性與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),近年來成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。結(jié)腸癌是世界三大惡性腫瘤之一,是一種高度異質(zhì)性的腫瘤,形態(tài)學(xué)、免疫表型、分子遺傳學(xué)上的差異導(dǎo)致了結(jié)腸癌對臨床治療的不同反應(yīng)及預(yù)后。腫瘤個(gè)體之間存在異質(zhì)性,在同一個(gè)體不同腫瘤區(qū)域以及轉(zhuǎn)移灶的相關(guān)基因組也存在一定差異。本課題將通過對不同結(jié)腸癌病人原位腫瘤組織、癌旁組織以及轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行全基因組SNP檢測,并通過生物信息學(xué)解析明確和發(fā)現(xiàn)個(gè)體癌細(xì)胞異質(zhì)性程度是否與病程和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。同時(shí),利用建立的基于熒光淬滅的SNP檢測方法對相關(guān)提示與結(jié)腸癌異質(zhì)性與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)SNP進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移灶的的拷貝數(shù)變異(Copy number variation, CNV)率顯著高于癌旁組織與原發(fā)灶(p0.01)。同時(shí)通過GO分析發(fā)現(xiàn)差異CNVs涉及的相關(guān)通路約有四分之一與粘附和免疫相關(guān)。而將腫瘤的轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶發(fā)生基因編碼區(qū)域SNP改變所涉及的基因進(jìn)行GO分析,所涉及的基因二分之一與轉(zhuǎn)移和免疫相關(guān),且涉及粘附和免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)通路也占到了約五分之一。同樣將腫瘤的轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的差異miRNAs涉及的靶基因進(jìn)行GO分析,發(fā)現(xiàn)涉及的基因約三分之一與轉(zhuǎn)移和免疫相關(guān),涉及粘附和免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)通路也占到了約五分之一。上述結(jié)果提示粘附與免疫調(diào)節(jié)可能是調(diào)控腫瘤發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵因素。通過芯片上轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶的SNP比較分析,并通過Quenching PCR擴(kuò)大驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)位于第14號染色體上的rs12881063位點(diǎn)在原發(fā)灶和癌旁組織中幾乎沒有產(chǎn)生突變,而在轉(zhuǎn)移灶中則出現(xiàn)比例較高的突變,在近端轉(zhuǎn)移中,突變率達(dá)到了66.7%,而在遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移中,突變率達(dá)到了83.3%。上述結(jié)果提示該位點(diǎn)的突變與可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移的能力相關(guān)在所有樣本的轉(zhuǎn)移灶中都產(chǎn)生了突變,這可能為臨床腫瘤分期診斷的潛在標(biāo)志物,并提供一定的依據(jù)。
[Abstract]:At present, the detection of gene SNP has become an important means to analyze and judge the characteristics of genetic diseases and individualized drug reactions. It is also an important means to predict and prevent many diseases. The current single nucleotide polymorphism (Single nucleotide polymorphism, SNP) detection methods, such as sequencing and Taq probe, have some drawbacks. A highly efficient fluorescence quenching based SNP method, Quenching-PCR method, is used to extend the single base of a specific sequence probe labeled with fluorescence quenching molecules with a fluorescent molecule labeled double deoxynucleoside three phosphoric acid on the specific loci of the gene, and then by detecting the fluorescence extended at the tip of the probe. The fluorescence quenching value of the base of the molecular marker is used to determine the base type of the extension of the tip of the probe, that is, the base type of the special site of the gene. Compared with the gold standard sequencing method, the consistency rate of the results of Quenching-PCR method is 93.40% and the agreement rate of the TaqMan probe method is 92.45%. Thus, the Quenching-PCR method and the TaqMan probe method can be seen in the criterion. There is no obvious difference in accuracy, but it is far superior to TaqMan probe in detection cost, detection time and probe design. Therefore, Quenching-PCR method is more easily applied in clinical diagnosis and is of great significance. On the basis of SNP detection method based on fluorescence quenching, we apply this method to the individualization of clinical related tumors. Detection of the routine site of drug use. The detection of epidermal growth factor receptor (EGFR) related loci with tyrosine kinase inhibitors, the insertion deletion of 2235_2249 in exon nineteenth of EGFR and the L858R of exon twenty-first in exon are closely related to the drug effect; meanwhile, it is also used. The multidrug resistance related protein 2 gene (Multidrug resistance-associated protein 2, MRP2) Val417Ile loci associated with the use of platinum drugs, the nucleotide excision and repair of the cross complementing group 1 (Excision repair cross-complementation group 1, ERCC1) rs3212986 site and the X line repair cross complementary group 1 gene The detection of Arg 194T RP site of nting 1, XRCC1). The results showed that Quenching PCR could be used for the detection of SNP in individual oncology loci, and also found that this method can be used not only for detection of SNP but also for the detection of insertion / deletion (Insert/Delete, InDel). The heterogeneity of tumor is closely related to tumor metastasis, and has been developed in recent years. Colon cancer is one of the three most malignant tumors in the world. It is a highly heterogeneous tumor. The differences in morphology, immunophenotype and molecular genetics lead to the different responses and prognosis of colon cancer to clinical treatment. Heterogeneity exists between individuals, in the same individual tumor regions and in metastatic foci. There are certain differences in the genomes. This topic will be detected by genomic SNP in tumor tissues, para cancer tissues and metastatic foci in different colon cancer patients. Through bioinformatics analysis, it is clear whether the degree of individual cancer cell heterogeneity is related to the course and metastasis. The quench SNP detection method verified the correlation with the heterogeneity of colon cancer and tumor metastasis associated with SNP. The results showed that the copy number variation (Copy number variation, CNV) in the metastasis of colon cancer was significantly higher than that of the para cancerous tissues and primary foci (P0.01). At the same time, the related pathways involved in the difference CNVs were found to be about four points by GO analysis. One is associated with adhesion and immunity, and GO analysis of the genes involved in the SNP change of the gene encoding region of the primary foci, the gene 1/2 involved is related to metastasis and immunity, and the related pathways involved in adhesion and immunomodulation are also about 1/5. The difference miRNAs involved in GO analysis of target genes, and found that about 1/3 of the genes involved were related to metastasis and immunity, and the related pathways involved in adhesion and immunomodulation were also about 1/5. The results suggested that adhesion and immunoregulation may be the key factor in regulating the occurrence and development of tumor. SNP comparative analysis of primary foci, and Quenching PCR enlargement, found that the rs12881063 loci on chromosome fourteenth had little mutation in the primary and paracancerous tissues, but a higher mutation in the metastasis, and the mutation rate reached 66.7% in the proximal metastasis, and the rate of mutation reached the distal metastasis. The above results suggest that mutations in the site may be associated with the ability of the metastasis of the tumor to produce mutations in all the metastases of the samples, which may be a potential marker for the diagnosis of clinical oncology and provide some basis for the 83.3%..
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.4;R440

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本文編號：2011479