本文選題：食管鱗癌 + CHFR��； 參考：《山東大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：背景食管癌占世界惡性腫瘤發(fā)病的第八位,死亡率第六位,90%的食管癌病理類型為鱗癌或者腺癌。食管鱗癌發(fā)生是由于食管鱗狀上皮增殖導(dǎo)致其從低級別不典型增生到重度不典型增生,再發(fā)展為浸潤性的鱗癌。我國食管癌分布較為廣泛,但也表現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異,中國北方的食管癌發(fā)病率總體較高。飲酒、食用腌制食品等含亞硝酸鹽高的食物、營養(yǎng)缺乏、感染因素和嗜食燙飲等是我國食管癌發(fā)病的主要原因,同時遺傳因素在食管癌的發(fā)病中也起著重要作用。惡性腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)包括遺傳和表觀遺傳兩方面。在遺傳學(xué)機制中發(fā)生了基因突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合丟失等現(xiàn)象,其特點是DNA序列發(fā)生了改變,引起基因表達(dá)水平也發(fā)生了改變。而表觀遺傳學(xué)則不同,指的是非基因序列改變的原因所導(dǎo)致的基因表達(dá)的改變。在惡性腫瘤的發(fā)生中遺傳和表觀遺傳異常是相互關(guān)聯(lián)的,無論是遺傳原因或是表觀遺傳原因單獨或是協(xié)同作用都可能導(dǎo)致細(xì)胞的惡變。表觀遺傳學(xué)是一個具有廣闊前景的生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。抑癌基因、DNA修復(fù)基因及侵襲轉(zhuǎn)移基因的啟動子甲基化等多種表觀遺傳機制在調(diào)控基因表達(dá)方面發(fā)揮了作用,其中研究熱點是DNA甲基化。在人類癌癥中DNA甲基化包括全基因組甲基化和特定位點CpG島啟動子甲基化,基因重復(fù)序列或長散在重復(fù)序列甲基化會導(dǎo)致基因重組或染色體缺陷,影響基因轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)定性。那么在食管鱗癌中抑癌基因甲基化發(fā)生率如何,其后果是否對腫瘤的發(fā)生產(chǎn)生影響,我們在本研究中選擇了兩個不同的抑癌基因,利用食管細(xì)胞系和臨床標(biāo)本研究食管鱗癌中抑癌基因的角色和作用。放射治療是臨床食管鱗癌治療的一種重要的手段,通常與手術(shù)及化療等聯(lián)合用于食管癌的治療。放射線直接對細(xì)胞的DNA發(fā)生作用,其影響包括(1).直接作用：射線損傷DNA分子鏈,造成DNA的單鏈或雙鏈斷裂；(2).間接作用：射線對水分子作用,產(chǎn)生電離效應(yīng),繼而產(chǎn)生H+、OH-自由基,自由基與生物大分子作用后引起DNA分子鏈結(jié)構(gòu)及功能的損害。相對于手術(shù)而言,射線治療優(yōu)點包括：(1).適應(yīng)癥廣,從原位癌到Ⅳ期癌腫的各期腫瘤均可行放射治療；(2).總體有效率較高,特別對于早期患者以及頸段食管患者,5年生存率甚至達(dá)到與手術(shù)相仿的水平； (3).對病例的適應(yīng)證手術(shù)適應(yīng)證寬松,更多患者可以從中獲益；(4).從技術(shù)角度而言放射治療較手術(shù)治療相對容易操作。放射治療或者輔助放射治療的選擇主要根據(jù)一些臨床病理參數(shù),如TNM分期,性別,年齡,分化程度等,但對于預(yù)測腫瘤的生物學(xué)行為、放射敏感性以及放射抵抗沒有合適的分子生物學(xué)標(biāo)記物。由于放射抵抗是導(dǎo)致放療失敗(無效)或癌腫復(fù)發(fā)的重要原因,目前對于食管鱗癌放射抵抗原因的研究尚且很少,DNA甲基化在放射抵抗中的作用于機制尚不明確。因此,在本研究就此進(jìn)行了實驗研究及深入探討。本研究目的如下：(1).通過研究食管鱗癌KYSE150, KYSE180細(xì)胞系輻照前后CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化程度變化及mRNA的表達(dá)變化,研究抑癌基因的甲基化及其基因表達(dá)能力的改變是否參與到食管鱗癌的放射抵抗。(2).通過研究28例食管鱗癌組織、癌旁組織及正常食管組織CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化與臨床病理關(guān)系,研究CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及意義。方法研究一、放射抵抗細(xì)胞系中CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化表達(dá)情況1.細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及輻照選擇KYSE150, KYSE180細(xì)胞系,在適量RPMI1640細(xì)胞液中輕輕吹打至散開后移入培養(yǎng)瓶內(nèi),置于37℃,5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、擴增,隨后進(jìn)行傳代。將在對數(shù)生長期生長的KYSE150, KYSE180細(xì)胞制作為細(xì)胞懸液,800rpm, 10min中離心,棄去上清,使用1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,將細(xì)胞分別接種在六孔板中,每孔1*105個細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁、密度在70%左右且狀態(tài)良好時,分別給予8Gy的高能量X射線(放射源距離標(biāo)本100cm,照射野大小為20cm×20cm,吸收劑量率為1.50Gy/min.)照射后,37℃、5%二氧化碳培養(yǎng),并及時更換培養(yǎng)液；細(xì)胞照射后第5天,以上述劑量再次處理細(xì)胞,并及時更換培養(yǎng)液,直至細(xì)胞凋亡、壞死后形成細(xì)胞克隆。將輻照耐受的細(xì)胞系稱為KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy細(xì)胞系。2.DNA的提取、甲基化處理及焦磷酸測序收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(KYSE150, KYSE180, KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy),2*106/管,加入DNA提取液200 μ 1,并加入10mg/ml的蛋白酶K至終濃度100μg/ml,使細(xì)胞完全裂解,之后56度,水浴2小時,向消化后的DNA樣品中加入250u1酚氯仿,蓋上管蓋,顛倒混勻。經(jīng)樣本離心,再次氯仿抽提,吸取上清后無水乙醇處理等步驟,最后向沉淀中加入100μlTE溶液,室溫溶解15分鐘,期間輕輕振蕩混勻,完成細(xì)胞系樣本中DNA的提取,提取后的DNA用重亞硫酸鹽處理完成甲基化。采用PyroMark Assay design 2.0針對CDKN2A和CHFR基因啟動子CpG島設(shè)計PCR引物和測序引物,按PyroMark PCR Kit試劑盒(德國,Qiagen)說明書要求完成焦磷酸測序前的PCR擴增反應(yīng)。3.樣本總mRNA提取及RT-PCR收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(KYSE150, KYSE180, KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy),2*106/管,每管加入1. Oml Trizol溶液,裂解細(xì)胞后加入氯仿處理,經(jīng)離心吸取上清加入異丙醇,冰上放置十分鐘后離心,吸去管中液體,75%乙醇處理后溶解RNA,完成RNA提取。取0.5ml EP管,將RNA與引物的混合物,將5 X buffer, DTT,逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV等反應(yīng)品順序加入進(jìn)行RT反應(yīng),得到cDNA,之后進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增,數(shù)據(jù)統(tǒng)計、結(jié)果分析等。4.放射抵抗細(xì)胞系與原始細(xì)胞系細(xì)胞增殖實驗KYSE150、KYSE150-8G、KYSE180及KYSE180-8G細(xì)胞起始接種濃度為1*105／瓶,分別于1,3,5,7天消化后計數(shù),配對比較細(xì)胞系增殖能力。研究二、食管鱗癌、癌旁及正常食管組織中CHFR, CDKN2A基因異常甲基化研究1.標(biāo)本來源28例標(biāo)本來選自2014.5.～2015.4.期間安徽省立醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的原發(fā)性食管鱗癌病例,其中男性25例,女性3例；病理分期Ⅰ期病例8例,Ⅱ期病例15例,Ⅲ期病例5例。實驗使用的組織樣本為腫瘤組織,腫瘤旁組織及距離腫瘤至少5cm以遠(yuǎn)的食管正常組織。本組病例手術(shù)前未行放療、化療,病理資料完整,術(shù)后長期隨訪,資料完備,上述病例來源的患者均已知情同意。2.DNA的提取、甲基化處理及焦磷酸測序在液氮中研磨組織標(biāo)本(100mg),加入DNA提取液200 μ1,繼續(xù)研磨至勻漿,并加入10mg/ml的蛋白酶K至終濃度100μ g/ml,之后56度,水浴2小時,向消化后的DNA樣品中加入250ul酚氯仿,蓋上管蓋,顛倒混勻。經(jīng)樣本離心,再次氯仿抽提,吸取上清后無水乙醇處理等步驟,最后向沉淀中加入100μl TE溶液,室溫溶解15分鐘,期間輕輕振蕩混勻,完成細(xì)胞系樣本中DNA的提取,提取后的DNA用重亞硫酸鹽處理完成甲基化。采用PyroMark Assay design 2.0針對CDKN2A和CHFR基因啟動子CpG島設(shè)計PCR引物和測序引物,按PyroMark PCRKit試劑盒(德國,Qiagen)說明書要求完成焦磷酸測序前的PCR擴增反應(yīng)。3.樣本mRNA提取及RT-PCR在液氮中研磨組織標(biāo)本(100mg),加入1. 0ml Trizol溶液,磨成勻漿,加入1. 0ml Trizol溶液,加入氯仿處理,經(jīng)離心吸取上清加入異丙醇,冰上放置十分鐘后離心,吸去管中液體,75%乙醇處理后溶解RNA,完成RNA提取。取0.5m1EP管將RNA與引物的混合物,將5 X buffer, DTT,逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)等反應(yīng)品順序加入進(jìn)行RT反應(yīng),最后進(jìn)行反應(yīng)及分析結(jié)果。結(jié)果研究一、1.KYSE150, KYSE180及KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy細(xì)胞系的DNA甲基化特異性檢測均發(fā)現(xiàn)CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化現(xiàn)象；2.放射抵抗的KYSE150-8Gy,KYSE180-8Gy細(xì)胞系中CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化程度高于KYSE150, KYSE180細(xì)胞系；3.而KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy細(xì)胞系CHFR及CDKN2A基因mRNA表達(dá)顯著低于KYSE150, KYSE180細(xì)胞系。4.KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy細(xì)胞系增殖能力顯著高于KYSE150, KYSE180細(xì)胞系,p0.05。研究二、1.28例患者完成了本研究,樣本為癌組織、癌旁組織及正常食管組織成對樣本。CHFR基因DNA甲基化發(fā)生率分別為46.32%、42.05%和22.33%; CDKN2A基因DNA甲基化發(fā)生率分別為27.51%、24.54%和10.89%。正常食管組織內(nèi)CHFR及CDKN2A基因甲基化發(fā)生率顯著低于癌組織及癌旁組織,但CHFR及CDKN2A基因甲基化與腫瘤分期無關(guān)。2. CHFR及CDKN2A基因mRNA在不同組織中的差異：CHFR和CDKN2A基因mRNA表達(dá)在癌組織及癌旁組織中顯著低于正常組織(p 0.001), CDKN2A基因mRNA表達(dá)在癌組織中也低于癌旁組織,差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.026)3. CHFR及CDKN2A基因mRNA在癌組織、癌旁組織及正常食管組織表達(dá)差異與臨床分期無關(guān)。4. mRNA在癌組織、癌旁及正常食管組織表達(dá)差異與腫瘤分化程度關(guān)系：CHFR基因mRNA在癌組織中表達(dá)差異與分化程度無關(guān),在癌旁組織中中分化癌與低分化癌表達(dá)程度具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.034)：在正常組織中表達(dá)差異與分化程度無關(guān)。CDKN2A基因mRNA在癌組織中表達(dá)差異與分化程度無關(guān),在癌旁組織中表達(dá)差異與分化程度無關(guān)；在正常組織中表達(dá)中分化癌與低分化癌表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.023)。結(jié)論研究一1.食管鱗癌CHFR及CDKN2A基因甲基化在KYSE-150、KYSE-180食管鱗癌細(xì)胞系是一種高發(fā)現(xiàn)象。2.大劑量輻照后,形成放射線耐受細(xì)胞系,KYSE-150-8Gy、KYSE-180-8Gy細(xì)胞中CHFR、CDKN2A基因甲基化程度高于原始細(xì)胞系,與此相對應(yīng)的CHFR、 CDKN2A基因mRNA表達(dá)顯著低于原始細(xì)胞系,說明CHFR、CDKN2A基因高甲基化導(dǎo)致的腫瘤抑制功能的喪失,使癌腫細(xì)胞DNA修復(fù)能力和抗凋亡能力顯著加強,并因此抗拒了放射線的滅活。3.放射抵抗細(xì)胞系KYSE150-8Gy, KYSE180-8Gy腫瘤增殖能力增強,具有更為惡性的生物學(xué)行為。研究二1.食管鱗癌癌組織、癌旁組織及正常組織中存在CHFR及CDKN2A基因甲基化現(xiàn)象,說明該基因甲基化是食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的一種表觀遺傳事件。2.正常組織甲基化比率顯著低于癌組織及癌旁組織,且與mRNA表達(dá)一致,說明CHFR及CDKN2A基因甲基化導(dǎo)致的失活可能也參與到食管鱗癌的發(fā)生階段。3. ESCC癌組織及癌旁組織中CHFR及CDKN2A甲基化比率顯著高于正常組織,mRNA表達(dá)顯著低于正常組織,但DNA甲基化程度與腫瘤分期無關(guān),說明在腫瘤的進(jìn)程中作為抑癌基因的CHFR及CDKN2A基因甲基化并由此導(dǎo)致的表達(dá)缺失貫穿于食管鱗癌的整個發(fā)展過程。4. CHFR及CDKN2A基因甲基化與腫瘤的分期無關(guān),與腫瘤的分化程度部分相關(guān)(CHFR的mRNA在中分化與低分化患者癌旁組織的表達(dá)有差異,CDKN2A的mRNA在中分化與低分化患者正常組織中表達(dá)有差異),說明CHFR及CDKN2A基因甲基化可能是食管鱗癌發(fā)生的早期分子事件,并與腫瘤的惡性程度有關(guān)。
[Abstract]:In this study , we have selected two different tumor suppressor genes , such as gene mutation , microsatellite instability and loss of heterozygosity . In the present study , we have selected two different tumor suppressor genes , such as gene mutation , microsatellite instability and loss of heterozygosity .
( 2 ) indirect effect : the effect of ray on water molecule , produces ionization effect , then produces H + , OH - free radical , free radical and biological macromolecule to cause damage of DNA molecular chain structure and function .
( 2 ) Overall response rate is high , especially for early and cervical esophagus patients , the 5 - year survival rate even reach the level similar to surgery ;
( 3 ) The indications of the indications for the case were loose , and more patients could benefit from them .
In this study , the changes of DNA methylation degree and mRNA expression of CHFR and CDKN2A gene before and after irradiation of KYSE150 and KYSE180 cell lines in esophageal squamous cell carcinoma were studied . The expression of CHFR and CDKN2A in esophageal squamous cell carcinoma was studied by means of DNA methylation of CHFR and CDKN2A in 28 cases of esophageal squamous cell carcinoma . The expression of CHFR and CDKN2A in esophageal squamous cell carcinoma was studied . after irradiation , culturing at 37 & deg ; C and 5 % carbon dioxide , and replacing culture solution in time ;
DNA extraction , methylation treatment and pyrophosphoric acid sequencing were used to extract 200 渭l of KYSE150 , KYSE180 , KYSE150 - 8Gy , KYSE180 - 8Gy . The results were as follows : 1 , 3 , 5 , 7 days after digestion , 5 X buffer , DTT and reverse transcriptase M - MLV were used to study the abnormal methylation of CHFR and CDKN2A .
DNA extraction , methylation treatment and sequencing of pyrophosphoric acid in liquid nitrogen were carried out . The results were as follows : 1 . KYSE150 , KYSE180 and KYSE150 - 8Gy , KYSE150 , KYSE180 and KYSE150 - 8Gy , KYSE180 - 8Gy cell line DNA methylation specific test found CHFR and CDKN2A gene DNA methylation ;
2 . The methylation degree of CHFR and CDKN2A in KYSE150 - 8Gy and KYSE180 - 8Gy cell lines was higher than that of KYSE150 and KYSE180 cell lines .
3 . KYSE150 - 8Gy , KYSE180 - 8Gy cell line CHFR and CDKN2A mRNA expression were significantly lower than KYSE150 and KYSE180 cell line . The mRNA expression of CHFR and CDKN2A mRNA was significantly lower than that in normal tissues ( p 0.001 ) . The expression of CHFR and CDKN2A mRNA in cancer tissues , adjacent tissues and normal esophageal tissues was not related to clinical stage .
The methylation of CHFR and CDKN2A gene in esophageal squamous cell carcinoma was significantly lower than that of the original cell line . The methylation rate of CHFR and CDKN2A gene was significantly lower than that of the original cell line . The methylation rate of CHFR and CDKN2A in ESCC and adjacent tissues was significantly higher than that in normal tissues , but the degree of DNA methylation was not related to the tumor stage , suggesting that the methylation of CHFR and CDKN2A gene as a suppressor gene in the progression of the tumor and the deletion of CDKN2A gene through the whole development of esophageal squamous cell carcinoma . The methylation of CHFR and CDKN2A was not related to the stage of tumor . The expression of CHFR and CDKN2A mRNA was different from that in poorly differentiated patients . The expression of CDKN2A mRNA in normal tissues of patients with low differentiation was different . The methylation of CHFR and CDKN2A may be an early molecular event in esophageal squamous cell carcinoma and is related to the degree of malignancy .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 朱應(yīng)超;田輝;岳韋名;高存;亓磊;司立博;;CHFR基因CpG島甲基化對食管癌Eca109細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J];中國腫瘤生物治療雜志;2011年02期

2 ;Downregulation of retinoic acid receptor-β_z expression is linked to aberrant methylation in esophageal squamous cell carcinoma cell lines[J];World Journal of Gastroenterology;2004年06期

，

本文編號：2011254