本文選題：EBP2 + c-Myc��； 參考：《華東師范大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：c-Myc是Myc蛋白家族的重要成員,它是細(xì)胞中一個非常重要的轉(zhuǎn)錄因子,它在細(xì)胞中有著多重的功能,調(diào)控了細(xì)胞增殖,代謝,血管新生以及DNA的修復(fù)。除此之外,c-Myc還是一個致癌蛋白,它在許多人類的癌癥中都發(fā)生上調(diào),并且能促進(jìn)多種腫瘤的形成。最近的研究表明,c-Myc是一個細(xì)胞中普遍存在的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子。c-Myc在細(xì)胞中主要分布在細(xì)胞核內(nèi),通過直接與DNA結(jié)合而調(diào)控多種基因的表達(dá)。除了細(xì)胞核質(zhì)的表達(dá)之外,c-Myc也在細(xì)胞質(zhì)以及核仁中分布。Myc-Nick是c-Myc的一個剪切體,定位在細(xì)胞質(zhì)中,調(diào)控細(xì)胞的分化。而核仁中定位的c-Myc對于核仁的生物合成起著非常重要的作用。c-Myc可以結(jié)合在核糖體DNA (rDNA)上,激活RNA聚合酶Ⅰ,進(jìn)而調(diào)控rDNA的轉(zhuǎn)錄。c-Myc在核仁中的功能被其自身的蛋白穩(wěn)定性以及它的結(jié)合蛋白嚴(yán)密的調(diào)控著。目前為止,SCF-Fbw7是報道的主要調(diào)控c-Myc蛋白穩(wěn)定性的E3泛素連接酶。最近的研究表明,NPM對于c-Myc的核仁定位是必需的,并且NPM能通過Fbw7非依賴的方式抑制c-Myc的降解。然而調(diào)控c-Myc核仁定位以及功能的機(jī)制還需要更深入的研究。EBP2 (ENBA1 binding protein 2)最初被發(fā)現(xiàn)是Epstein-Bair病毒(EBV)核抗原1的結(jié)合蛋白,在EBV的分裂中非常重要。酵母中的EBP2同源蛋白在前核糖體RNA(pre-rRNA)的剪切和核糖體亞單元組裝中非常重要。在哺乳細(xì)胞中,EBP2與nucleostemin結(jié)合并定位在核仁中。除此之外,人體細(xì)胞中EBP2在有絲分裂時能與染色體結(jié)合。在293細(xì)胞和NIH3T3細(xì)胞中過表達(dá)EBP2被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞增殖和染色體不穩(wěn)定有關(guān)系。最近的報道證明EBP2對于Fbw7γ在核仁中的定位非常重要。然而EBP2在哺乳動物中的功能并不清楚。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)EBP2是一個全新的c-Myc結(jié)合蛋白。我們分別通過免疫熒光的實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EBP2能明顯的促進(jìn)c-Myc的細(xì)胞核仁的定位,而如果將EBP2沉默則會導(dǎo)致c-Myc核仁定位的缺失。同時,我們還利用亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離的方法驗證了這一結(jié)果。由于c-Myc的核仁定位會被其共結(jié)合蛋白調(diào)控,我們推測c-Myc能與EBP2發(fā)生直接的相互作用。我們利用免疫共沉淀的方法證明了c-Myc與EBP2蛋白確實可以發(fā)生直接的相互作用,并且內(nèi)源的免疫共沉淀也表明內(nèi)源的c-Myc蛋白與EBP2蛋白也是相互作用的。同時,體外pull down的實驗證明了c-Myc蛋白與EBP2蛋白的相互作用是直接的。并且我們構(gòu)建了一些列c-Myc和EBP2的截短型缺失突變的質(zhì)粒,通過免疫共沉淀的方法找到了c-Myc與EBP2相互作用的具體結(jié)構(gòu)域—EBP2蛋白的氮末端介導(dǎo)了其與c-Myc的相互作用,而c-Myc蛋白的氮末端與碳末端對于介導(dǎo)其與EBP2的相互作用都非常重要,并且免疫熒光的實驗也進(jìn)一步驗證了這一結(jié)果。接著,我們進(jìn)一步的實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)EBP2還能從蛋白水平穩(wěn)定c-Myc。表達(dá)劑量增加的EBP2會導(dǎo)致c-Myc蛋白的含量隨著EBP2表達(dá)的增加而增加,并且過表達(dá)EBP2會增加c-Myc蛋白的半衰期。相反的,如果沉默EBP2會導(dǎo)致c-Myc蛋白表達(dá)量的減少,并且明顯縮短了c-Myc蛋白的半衰期。進(jìn)一步我們發(fā)現(xiàn)EBP2穩(wěn)定c-Myc蛋白是通過Fbw7非依賴的方式。同時,在實驗中我們還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)c-Myc也能增加EBP2的蛋白水平。我們證明了c-Myc促進(jìn)EBP2蛋白水平增加是通過調(diào)控EBP2的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。染色質(zhì)免疫共沉淀的實驗證明了c-Myc可以結(jié)合在EBP2啟動子區(qū)域的E-box區(qū)域。并且熒光素酶報告基因的實驗也表明c-Myc確實可以通過結(jié)合EBP2的啟動子區(qū)域促進(jìn)EBP2的轉(zhuǎn)錄,而如果將EBP2啟動子區(qū)域E-box區(qū)域突變?yōu)閏-Myc不能結(jié)合的序列,則c-Myc就不能促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。由此,EBP2能促進(jìn)c-Myc的核仁定位并穩(wěn)定其蛋白水平,而c-Myc又通過一種正反饋調(diào)控的形式促進(jìn)EBP2的轉(zhuǎn)錄。功能上,EBP2在肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)。并且過表達(dá)EBP2能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖,以及肺癌細(xì)胞在裸鼠中的成瘤能力。同時我們在人肺癌和癌旁組織的中檢測了c-Myc和EBP2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)EBP2在人肺癌組織中同樣高表達(dá),并且這種表達(dá)量的上調(diào)與c-Myc的表達(dá)量上調(diào)成很好的正相關(guān)。由此,我們發(fā)現(xiàn)EBP2是一種潛在的癌基因,在肺癌中高表達(dá),并促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。并且我們發(fā)現(xiàn)EBP2是通過促進(jìn)c-Myc激活的rDNA的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)c-Myc介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的增殖。
[Abstract]:c - Myc is a very important transcription factor in the cell and regulates cell proliferation , metabolism , angiogenesis and DNA repair . EBP2 can promote the localization of c - Myc and stabilize its protein level , while c - Myc promotes the transcription of EBP2 in the form of positive feedback . The expression of c - Myc and EBP2 in human lung cancer cells is also detected by overexpression of EBP2 .
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-3

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本文編號：2008333