發(fā)布時(shí)間：2018-06-09 15:16

  本文選題：垂體腺瘤 + 乳酸脫氫酶A�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：垂體腺瘤(pituitary adenoma,PA)是顱內(nèi)常見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(約占顱內(nèi)腫瘤10-15%),多起源于垂體前葉,患者臨床表現(xiàn)為腫瘤壓迫以及腫瘤引起的激素異常分泌導(dǎo)致的癥狀。PA為單克隆起源的良性腫瘤,雖然其在組織學(xué)上為良性,但是部分腫瘤侵襲浸潤瘤周組織,呈侵襲性生長,為侵襲性PA。侵襲性PA在生物學(xué)行為上更偏向于惡性,且有較強(qiáng)的增殖能力,手術(shù)難以完全切除且術(shù)后易復(fù)發(fā),患者預(yù)后差。因此研究調(diào)控PA侵襲性發(fā)生的分子機(jī)制,探索治療侵襲性PA的新方法具有很現(xiàn)實(shí)的臨床意義�！巴卟裥�(yīng)”指出:腫瘤細(xì)胞糖代謝顯著高于正常細(xì)胞,即使在氧氣充足條件下腫瘤細(xì)胞也偏向于通過無氧酵解產(chǎn)生能量,這種異常增高的糖酵解與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。乳酸脫氫酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)是糖酵解的關(guān)鍵酶之一,其在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá),并且調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為。同時(shí)有報(bào)道PA的葡萄糖攝取能力顯著高于正常垂體,大腺瘤攝取葡萄糖的能力較微腺瘤顯著增高。這些證據(jù)強(qiáng)烈提示PA增殖侵襲等生物學(xué)行為可能與異常糖代謝的密切相關(guān)。為了探究LDHA在侵襲性PA發(fā)生發(fā)展中的的作用及機(jī)制,我們首先在PA臨床病理標(biāo)本中檢測LDHA的基因及蛋白表達(dá),并且結(jié)合臨床資料分析LDHA蛋白水平與腫瘤侵襲增殖等生物學(xué)行為的相關(guān)性;在PA細(xì)胞系中探究了LDHA的生物學(xué)作用及相應(yīng)機(jī)制;在PA裸鼠模型中體內(nèi)驗(yàn)證LDHA的作用;選用LDHA特異性化學(xué)抑制劑草氨酸鹽(oxamate)在PA細(xì)胞系、體內(nèi)動物模型及原代細(xì)胞層面探索了其對于PA侵襲及增殖的影響及相關(guān)機(jī)制。最后我們在PA細(xì)胞系GH3中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床的抗糖尿病藥物二甲雙胍(Metformin,Met)顯著下調(diào)了LDHA基因表達(dá),因此我們進(jìn)一步利用GH3細(xì)胞系及原代PA細(xì)胞探究了Met在PA增殖中的作用。通過以上研究我們初步闡明LDHA在侵襲性PA發(fā)生發(fā)展中的作用,并且探索了可能應(yīng)用于侵襲性PA治療的新方法,以期為侵襲性PA臨床診斷及治療開辟新的方向。實(shí)驗(yàn)方法:第一部分選取PA臨床手術(shù)標(biāo)本,利用q RT-PCR和免疫組化的方法分別檢測LDHA在腫瘤標(biāo)本中基因及蛋白的表達(dá)。并且結(jié)合臨床病例資料分析LDHA蛋白表達(dá)與PA侵襲及增殖能力的相關(guān)性。第二部分體外培養(yǎng)GH3垂體腺瘤細(xì)胞系,慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞上調(diào)LDHA表達(dá),比色法檢測各組細(xì)胞乳酸產(chǎn)生,行transwell及CCK8實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲及增殖能力,并且利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及周期分布,western-blot檢測各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)。第三部分選取不同濃度LDHA特異性化學(xué)抑制劑oxamate處理GH3細(xì)胞,比色法及2-NBDG分別檢測各組細(xì)胞乳酸產(chǎn)生及葡萄糖吸收,transwell及CCK8實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲及增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布與凋亡,選用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒測定各組細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,利用JC-1染色法檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位的變化,western-blot檢測各組細(xì)胞線粒體凋亡途徑相關(guān)調(diào)控蛋白的表達(dá)。建立PA荷瘤裸鼠動物模型,在體研究oxamate對PA體內(nèi)生長的影響及相關(guān)機(jī)制。選取PA臨床手術(shù)標(biāo)本,培養(yǎng)并鑒定原代PA細(xì)胞,oxamate處理原代細(xì)胞后檢測不同處理組細(xì)胞的侵襲及增殖能力。第四部分選用不同濃度Met處理GH3細(xì)胞,CKK-8實(shí)驗(yàn)檢測不同處理組細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期分布及凋亡,同時(shí)對Met處理組細(xì)胞行基因芯片分析篩選差異表達(dá)基因,對Met誘導(dǎo)GH3細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行初步探討,最后在原代PA細(xì)胞中驗(yàn)證Met對PA增殖活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.LDHA在侵襲性PA中高表達(dá),且與腫瘤的增殖活性正性相關(guān)(1)侵襲性PA的LDHA表達(dá)水平在m RNA及蛋白層面均顯著高于非侵襲性PA。(2)LDHA的蛋白表達(dá)與增殖指數(shù)Ki-67呈正相關(guān)(p0.05)。2.LDHA促進(jìn)GH3細(xì)胞糖酵解、侵襲及增殖(1)GH3細(xì)胞中過表達(dá)LDHA可以促進(jìn)細(xì)胞乳酸產(chǎn)生及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GLUT-1)的蛋白表達(dá)。(2)GH3細(xì)胞中過表達(dá)LDHA可以促進(jìn)細(xì)胞侵襲及侵襲相關(guān)的調(diào)控蛋白(MMP-2)表達(dá)。(3)GH3細(xì)胞中過表達(dá)LDHA激活A(yù)KT,抑制了GSK3β活性,上調(diào)了細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1表達(dá),促進(jìn)了細(xì)胞周期進(jìn)展,但是對細(xì)胞凋亡無明顯影響。3.特異性LDHA抑制劑oxamate對PA細(xì)胞系GH3、體內(nèi)PA及原代PA細(xì)胞糖酵解、侵襲及增殖的影響(1)oxamate顯著降低了GH3細(xì)胞乳酸產(chǎn)生、葡萄糖吸收及GLUT-1蛋白表達(dá)。(2)oxamate顯著降低了GH3細(xì)胞侵襲能力并且下調(diào)侵襲相關(guān)的調(diào)控蛋白(MMP2)的表達(dá)。(3)oxamate顯著降低了GH3細(xì)胞增殖活性。(4)oxamate抑制GH3細(xì)胞AKT活性,活化了GSK3β活性,下調(diào)了細(xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin D1表達(dá),阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期。(5)oxamate誘導(dǎo)了GH3細(xì)胞凋亡,促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,降低細(xì)胞線粒體膜電位,上調(diào)了Bax及Cleaved-Caspase3蛋白表達(dá),抑制了Bcl-2蛋白表達(dá)。ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)可以逆轉(zhuǎn)oxamate的促凋亡作用。(6)上調(diào)LDHA促進(jìn)GH3細(xì)胞體內(nèi)增殖,oxamate顯著抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長。(7)上調(diào)LDHA顯著促進(jìn)體內(nèi)腫瘤Cyclin D1及MMP2蛋白表達(dá),oxamate抑制了Cyclin D1及MMP2蛋白表達(dá)并且促進(jìn)了凋亡信號分子Cleaved-Caspase3表達(dá)。(8)oxamate顯著抑制了原代PA細(xì)胞的侵襲及增殖活性。4.Met抑制GH3細(xì)胞及原代PA細(xì)胞增殖(1)Met顯著抑制GH3細(xì)胞增殖活性。(2)干擾GH3細(xì)胞ATF3顯著降低了Met誘導(dǎo)的凋亡信號分子Cleaved-Caspase3的蛋白表達(dá)。(3)Met有效抑制了原代PA細(xì)胞的增殖活性。結(jié)論:1.LDHA在侵襲性PA中通常表達(dá)上調(diào),且表達(dá)水平與腺瘤的增殖活性呈正相關(guān)。2.過表達(dá)LDHA可以促進(jìn)GH3細(xì)胞糖酵解及侵襲,通過調(diào)控AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路可以促進(jìn)GH3細(xì)胞周期進(jìn)展進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。3.特異性LDHA抑制劑oxamate可以有效抑制GH3細(xì)胞糖酵解及侵襲,通過調(diào)控AKT-GSK3β-Cyclin D1信號通路阻滯GH3細(xì)胞周期進(jìn)展及ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑促進(jìn)GH3細(xì)胞凋亡。4.Met可以有效抑制PA細(xì)胞增殖。
[Abstract]:In order to investigate the role and mechanism of LDHA in the development of invasive PA , it is suggested that the effect of LDHA in the development of invasive PA is significantly higher than that of normal cells . In this paper , the expression of cell cycle and proliferation of the cells were detected by using reactive oxygen species ( ROS ) assay . The results showed that : 1 . The expression of LDH in GH3 cells was significantly lower than that of non - invasive PA . ( 4 ) oxamate inhibits the activity of GH3 cells , activates GSK3 beta activity , down - regulates the expression of cyclin D1 in GH3 cells , blocks cell cycle in G0 / G1 phase .
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R736.4

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本文編號：2000162