本文選題：CXCR4/CXCL12 + 軸�。� 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：目的:腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,目前已成為化療耐藥的新靶標(biāo)。趨化因子受體CXCR4和其特異性配體CXCL12(SDF-1)、Axl受體酪氨酸激酶和其配體Gas6是介導(dǎo)腫瘤細胞與其微環(huán)境相互作用的兩個關(guān)鍵的配體-受體對;阻斷CXCR4/CXCL12的相互作用可抑制乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成,而Axl拮抗劑能逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥。本研究的目的是擴展實驗室前期研發(fā)的CXCR4拮抗多肽E5在腫瘤治療中的適應(yīng)癥,探究E5聯(lián)合化療藥對乳腺癌小鼠模型的治療效果及其作用機理。同時,篩選與Axl具有高結(jié)合力的新型多肽分子,探究其與不同腫瘤細胞的作用及與化療耐藥的關(guān)系。方法:利用流式細胞術(shù)檢測人急性髓系白血病細胞(HL60、U937、THP-1、NB-4)、人慢性髓系白血病細胞K562和人乳腺癌細胞MCF7在化療藥暴露環(huán)境中,及多種耐藥細胞株表面Axl的表達,評價Axl與化療耐藥的相關(guān)性;檢測系列合成多肽分子與K562和MCF7/R的結(jié)合力,篩選與Axl具有高結(jié)合力的多肽。通過逐步增加阿糖胞苷濃度,反復(fù)刺激U937細胞,構(gòu)建U937耐藥株(U937R)。利用流式細胞術(shù)檢測E5與小鼠乳腺癌細胞4T1、人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVEC和小鼠骨髓基質(zhì)細胞MS-5的結(jié)合力,評價E5的特異性。利用CCK8檢測E5對4T1、HUVEC和MS-5細胞活性的影響。利用Annexin V/PI雙染和Western blot評價E5對4T1細胞的殺傷作用。利用Transwell遷移小室檢測E5對CXCL12和MS-5條件培養(yǎng)基介導(dǎo)的4T1和HUVEC細胞遷移的影響。用CCK8方法檢測E5對基質(zhì)細胞介導(dǎo)的4T1細胞粘附的影響。建立4T1與MS-5細胞、MS-5條件培養(yǎng)基和CXCL12共培養(yǎng)體系,通過CCK8法檢測E5聯(lián)合多種化療藥對4T1細胞的殺傷作用。將E5與紫杉醇或環(huán)磷酰胺聯(lián)合,治療皮下接種4T1乳腺癌細胞的小鼠;通過監(jiān)測小鼠腫瘤尺寸來評價治療效果。用Western blot檢測小鼠腫瘤組織中CXCR4、CXCR4相關(guān)下游信號蛋白p-Akt、p-Erk及血管內(nèi)皮細胞標(biāo)記分子CD31的表達,探討E5提高化療藥治療效果的作用機理。將FITC標(biāo)記的E5皮下注射至小鼠體內(nèi)后,利用活體成像系統(tǒng)和熒光酶標(biāo)儀分別檢測小鼠組織器官和血液中的熒光強度來評價E5在健康小鼠體內(nèi)的代謝情況。用高效液相色譜檢測E5在體外的貯藏穩(wěn)定性。結(jié)果:(1)E5能與表達CXCR4的4T1細胞和HUVEC細胞特異性結(jié)合;對4T1細胞的殺傷作用具有濃度依賴性,低于25 μM的E5對細胞活性無明顯影響,高于25μM時,可誘導(dǎo)細胞凋亡。E5能有效抑制CXCL12和MS-5條件培養(yǎng)基介導(dǎo)的4T1細胞的遷移以及由MS-5細胞介導(dǎo)的4T1細胞的粘附。在MS-5細胞、MS-5條件培養(yǎng)基或CXCL12存在條件下,E5能有效提高4T1細胞對紫杉醇、欖香烯或順鉑的敏感性。在乳腺癌小鼠模型中,E5能降低腫瘤組織中CXCR4、p-Akt、p-Erk和CD31的表達,抑制腫瘤血管生成,提高紫杉醇或環(huán)磷酰胺的抗腫瘤效果。在健康小鼠體內(nèi),E5主要通過肝臟代謝,注射2 h后可達到最高血藥濃度,半衰期約為10 h。E5在37℃可存放9天,在4℃可存放5個月。(2)化療藥瞬時刺激能誘導(dǎo)U937和K562細胞表面Axl的表達;Axl的配體Gas6能明顯提高K562細胞表面Axl的表達。建立了 U937阿糖胞苷耐藥株,U937R。與正常細胞株相比,血液腫瘤細胞HL60、U937、K562的耐藥株(HL60/A、U937R、K562/A)表面Axl的表達有所不同,HL60/A無明顯變化、U937R有輕微升高,K562/A有明顯降低;實體瘤細胞MCF7耐藥株(MCF7/R)Axl的表達明顯升高。從高表達Axl的細胞株K562和MCF7/R上篩選出與Axl具有高結(jié)合力的多肽,命名為A2-7,為后續(xù)工作奠定基礎(chǔ)。結(jié)論:E5通過拮抗CXCR4/CXCL12軸有效抑制了由CXCL12介導(dǎo)的小鼠乳腺癌4T1細胞的遷移和粘附功能,增加了 4T1細胞對化療藥的敏感性,提高了化療藥對乳腺癌小鼠的治療效果。E5通過阻斷對血管內(nèi)皮前體細胞的招募抑制腫瘤血管的生成。E5具有較好的體內(nèi)穩(wěn)定性,半衰期約為10 h。在37℃貯藏條件下易降解,在4℃可存放5個月。多肽A2-7與K562、MCF7/R細胞表面的Axl具有較高結(jié)合力,可能是一種潛在的Axl拮抗多肽。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of E5 on the growth , metastasis and tumor angiogenesis of human breast cancer mice by means of flow cytometry . The effect of E5 on proliferation , metastasis and tumor angiogenesis of human breast cancer mice was investigated by using flow cytometry . The expression of Axl in human breast cancer cell line K562 and MCF7 / R was significantly higher than that of normal cell line .
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R73-36

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