本文選題：Imp2 + 膠質(zhì)瘤��； 參考：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：本實驗以人膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本、膠質(zhì)瘤細(xì)胞系為研究對象,研究Imp2在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá),以及其對膠質(zhì)瘤生物學(xué)功能的影響和潛在分子機制。本實驗共分2部分:1.Imp2在人GBM中的表達(dá)及其對細(xì)胞生長的影響。胰島素樣生長因子2結(jié)合蛋白-2(Insulin-like growth factor 2 m RNA-binding protein 2,IGF2BP2,Imp2)是人腦發(fā)育過程中起重要作用的蛋白,研究發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯增高。近期研究發(fā)現(xiàn)Imp2作為致癌基因在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用,DNA微陣列和組織芯片技術(shù)亦已證實,Imp2在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與其惡性程度呈正相關(guān)[3]。為了研究Imp2在GBM和正常腦組織中的表達(dá)差異,我們比較了49例臨床GBM膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本,和6例正常腦組織。結(jié)果在49例GBM臨床標(biāo)本中,43例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中Imp2 m RNA(median log2 ratio=1.424),而正常腦組織標(biāo)本中Imp2 m RNA(median log2 ratio=-0.13),表明GMB組織標(biāo)本中Imp2 m RNA的表達(dá)水平升高。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,49例GBM組織標(biāo)本中32例高表達(dá)Imp2,占65.3%,表明在GBM中,Imp2的蛋白表達(dá)也顯著上調(diào)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的30例GBM組織標(biāo)本與4例正常腦組織,進(jìn)行比較計算Imp2表達(dá)的差異,算得GBM組織中,Imp2的表達(dá)明顯升高(P=0.001)。通過前面的實驗我們發(fā)現(xiàn)并證實了在GBM組織中Imp2存在異常表達(dá),為了進(jìn)一步探討Imp2對GBM細(xì)胞增殖侵襲等特征的影響,我們建立了人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251的Imp2穩(wěn)定過表達(dá)和沉默細(xì)胞模型。Western blot結(jié)果表明我們成功的建立了Imp2過表達(dá)和敲除細(xì)胞模型。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示,與轉(zhuǎn)入Vector的U87及U251細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)入Imp2過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞有更強的增殖能力,相反,沉默Imp2會導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力減弱。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果提示:用U87和U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染Imp2,或者轉(zhuǎn)染Vector,我們發(fā)現(xiàn)Imp2過表達(dá)組細(xì)胞遷移速度明顯大于Vector組(P0.05);Imp2基因沉默組細(xì)胞的遷移速度明顯小于對照Scramble組(P0.05),表明Imp2表達(dá)量的高低直接影響了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。transwell實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):過表達(dá)Imp2可以明顯增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力(P0.01),而沉默Imp2導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性減弱(P0.05)。這些結(jié)果說明,Imp2過表達(dá)可以增加U87和U251GBM細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力;沉默Imp2細(xì)胞可以顯著降低細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。綜上所述,我們驗證了在人的GBM膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中,Imp2 m RNA及蛋白高表達(dá)。在Imp2異常表達(dá)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中,Imp2對細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力都有影響,我們進(jìn)一步用實驗探討其可能機制。2.Imp2通過IGF2/PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和耐藥為了進(jìn)一步探討Imp2參與調(diào)控GBM增殖、遷移及侵襲的分子機制及可能涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,以及Imp2在GBM上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和耐藥中的作用。我們首先檢測了在Imp2過表達(dá)和沉默模型中其下游靶蛋白IGF2的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)或者沉默Imp2的細(xì)胞中IGF2 m RNA的表達(dá)無明顯變化,而IGF2蛋白表達(dá)水平在Imp2過表達(dá)細(xì)胞中升高而在Imp2沉默細(xì)胞中降低,說明Imp2主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)IGF2的表達(dá),導(dǎo)致IGF2 m RNA翻譯增加,使細(xì)胞產(chǎn)生并分泌出更多的IGF2,進(jìn)而與靶細(xì)胞表面的IGF1R受體結(jié)合,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。其次,有研究證實在其他細(xì)胞中,IGF2與IGF1R受體結(jié)合之后導(dǎo)致PI3K/Akt信號通路激活,促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用。因此本研究也檢測了GBM細(xì)胞中P-Akt和Akt蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):U87和U251細(xì)胞中,過表達(dá)Imp2導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p-Akt表達(dá)水平上升,而沉默Imp2導(dǎo)致p-Akt表達(dá)水平下降;Akt蛋白的表達(dá)不受Imp2的影響。這提示在膠質(zhì)瘤中,Imp2可能也是通過激活依賴Akt磷酸化的信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。第三,為了驗證Imp2是否通過PI3K-AKT信號通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲,我們選用通路中關(guān)鍵蛋白的抑制劑,IGF2的中和抗體IGF2 Ab和PI3K抑制劑LY294002,抑制IGF2或者PI3K蛋白,阻斷這個信號通路,再來觀察Imp2對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。在U87和U251 Imp2過表達(dá)和對照組細(xì)胞中,加入IGF2 Ab和LY294002抑制IGF2或者PI3K蛋白之后,二者能部分或者全部抵消了Imp2過表達(dá)所帶來的增強膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)。表明Imp2通過IGF2/PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。在Vector對照組細(xì)胞中,加入IGF2中和抗體阻斷IGF2,發(fā)現(xiàn)GBM細(xì)胞遷移和侵襲的能力顯著降低(P0.05);在Imp2過表達(dá)細(xì)胞中,加入同濃度的IGF2中和抗體,與加入PBS的對照組相比,細(xì)胞的遷移和侵襲能力都顯著下降(P0.05)。加入PI3K阻斷劑LY294002,行細(xì)胞劃痕和Transwell實驗,發(fā)現(xiàn)無論在Vector轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,還是在Imp2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中,與加入DMSO的對照組相比,細(xì)胞的遷移和侵襲能力都顯著下降。這些結(jié)果表明Imp2通過IGF2/PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)了GBM細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲作用。第四,眾所周知,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤發(fā)展和惡化中的重要機制,并且PI3K/Akt通路在這個過程中發(fā)揮了核心作用。因此我們推測Imp2可能通過PI3K/Akt通路參與GBM的EMT。RT-PCR和western blot結(jié)果顯示Imp2過表達(dá)可以在m RNA和蛋白水平導(dǎo)致E-cadherin下降和Vimentin、N-cadherin表達(dá)升高,而沉默Imp2可以升高E-cadherin表達(dá)并且減低Vimentin和N-cadherin的表達(dá)。提示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化也許在Imp2調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力的重要機制。最后,耐藥實驗發(fā)現(xiàn),與沉默Imp2的U87耐藥細(xì)胞和普通U87耐藥細(xì)胞相比,Imp2過表達(dá)的細(xì)胞在不同的TMZ濃度下其增殖能力均強于相應(yīng)的對照組細(xì)胞,抑制Imp2表達(dá)可導(dǎo)致GBM細(xì)胞的增殖能力減弱。細(xì)胞形成克隆實驗表明:Imp2過表達(dá)和沉默的U87耐藥細(xì)胞在未加入TMZ情況下,細(xì)胞形成克隆數(shù)目在組間無差異。在50μM和100μM的TMZ濃度下,過表達(dá)Imp2的U87-RE細(xì)胞與U87-RE細(xì)胞相比,細(xì)胞克隆形成數(shù)目都顯著提高(P0.05)。而沉默Imp2的U87-RE細(xì)胞與對照U87-RE細(xì)胞相比,細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著降低(P0.05)。這些結(jié)果表明Imp2參與了GBM細(xì)胞對替莫唑胺敏感性的調(diào)節(jié)。通過本研究我們證實了Imp2在GBM的異常表達(dá)不僅參與了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,也在其EMT和對替莫唑胺的耐藥性中發(fā)揮了重要作用,這些作用可能是通過PI3K-AKT信號通路所介導(dǎo)。
[Abstract]:Insulin - like growth factor 2 ( IGF2BP2 , Imp2 ) plays an important role in human brain development . The results showed that Imp2 overexpression could increase the proliferation , migration and invasion ability of glioma cells . The results showed that Imp2 overexpression could increase the proliferation , migration and invasion ability of glioma cells . The effect of Imp2 on the proliferation , migration and invasion of glioma cells was investigated . The results showed that Imp2 overexpression and silencing of U87 - RE cells induced E - cadherin decreased and vimentin and N - cadherin increased significantly ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1987753