本文選題：家蠅幼蟲抗菌肽粗提物 + FBL-3原代細(xì)胞��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:1.本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建C57BL/6小鼠紅白血病模型,得到更接近體內(nèi)狀態(tài)的原代FBL-3細(xì)胞,而眾多腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均采用已傳代的細(xì)胞株。紅白血病動(dòng)物模型構(gòu)建的成功,是得到FBL-3原代細(xì)胞的重要前提。2.將家蠅幼蟲抗菌肽粗提物調(diào)整為不同濃度作用于FBL-3原代細(xì)胞,探索抑殺FBL-3原代細(xì)胞的最佳濃度。3.在顯微鏡下,我們能夠觀察到大量的細(xì)胞碎片,并可以看到細(xì)胞質(zhì)外涌。到底家蠅幼蟲抗菌肽究竟通過怎樣的方式起作用?將異硫氰酸熒光素(FITC)連接于抗菌肽,并作用于FBL-3細(xì)胞和另外一種腫瘤細(xì)胞MCF-7,經(jīng)由激光共聚焦熒光顯微鏡觀察來探索抗菌肽抑制腫瘤細(xì)胞的作用方式。方法:篩選適合構(gòu)建模型的健康小鼠,構(gòu)建紅白血病動(dòng)物模型。由于C57BL/6小鼠模型重復(fù)性好、周期短,因此適合于構(gòu)建紅白血病模型。我們選擇了同種異體移植的方法構(gòu)建模型。先將用于移植的FBL-3細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)。待到細(xì)胞對(duì)數(shù)期時(shí),處理細(xì)胞并計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.25×106個(gè)/m L。將腫瘤細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射入C57BL/6小鼠體內(nèi),隨時(shí)觀察小鼠精神狀態(tài),并觸摸小鼠的淋巴結(jié)及胸腺處是否有腫塊出現(xiàn)。處死模型小鼠,將腫塊剝離,剪碎并研磨腫塊,獲得腫瘤細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶,于37℃、5%的CO2溫箱中培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長狀況。蘸取大腸桿菌,針刺誘導(dǎo)家蠅三齡幼蟲,培養(yǎng)24 h。通過研磨,離心,固相萃取及真空低溫凍干,獲得家蠅抗菌肽粗提物。將抗菌肽濃度依次調(diào)整為150、250、350、450μg/m L后作用于FBL-3原代細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。利用臺(tái)盼藍(lán)染色,計(jì)算細(xì)胞的存活率。再經(jīng)CCK-8試劑盒檢測不同濃度抗菌肽作用下FBL-3原代細(xì)胞的細(xì)胞毒性,最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗菌肽后,作用于FBL-3細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞,孵育4 h。制作臨時(shí)細(xì)胞標(biāo)本,利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察抗菌肽作用下的腫瘤細(xì)胞,以此來證實(shí)抗菌肽抗非實(shí)體瘤細(xì)胞FBL-3的作用機(jī)制。結(jié)果:采用同種異體移植的方法,可觀察到約一周左右C57BL/6小鼠腋下長出腫塊并蔓延到整個(gè)胸腺處,小鼠狀態(tài)萎靡,之后經(jīng)剝離處理的腫塊可以培養(yǎng)出能夠快速增殖的且可多次傳代的FBL-3細(xì)胞。經(jīng)抗菌肽作用后,通過倒置顯微鏡觀察,視野中出現(xiàn)了大量的細(xì)胞碎片,并可看到細(xì)胞質(zhì)外涌跡象。經(jīng)過臺(tái)盼藍(lán)染色,并計(jì)數(shù),計(jì)算得到細(xì)胞存活率。隨著抗菌肽濃度的增大,存活率呈先增大后減小的走向。隨后,通過CCK-8試劑盒來檢測不同濃度抗菌肽作用下FBL-3原代細(xì)胞的細(xì)胞毒性,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,可知:各實(shí)驗(yàn)組與正常組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。250、300、350μg/m L,兩兩比較,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。細(xì)胞毒性隨抗菌肽混合物濃度的增加先增大后減小,在300μg/m L作用下,其毒性最大。抑殺FBL-3細(xì)胞的機(jī)制如何?我們通過抗菌肽和異硫氰酸熒光素(FITC)連接,利用激光共聚焦熒光顯微鏡,發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞發(fā)出熒光綠。同時(shí),還用連接了FITC的抗菌肽作用MCF-7細(xì)胞,驗(yàn)證了抗菌肽對(duì)MCF-7細(xì)胞有抑殺作用。結(jié)論:篩選健康的C57BL/6小鼠,采用同種異體移植的方法,經(jīng)尾靜脈注射FBL-3細(xì)胞,成功構(gòu)建C57BL/6小鼠的紅白血病模型,獲得FBL-3原代細(xì)胞。我們通過不同濃度的抗菌肽干擾從小鼠模型中獲取的FBL-3原代細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)抗菌肽對(duì)于FBL-3原代細(xì)胞的作用并不是隨著抗菌肽濃度的增大而增強(qiáng)。將實(shí)驗(yàn)組按濃度分為150、200、250、300、350、400μg/m L組,300μg/m L組檢測到細(xì)胞毒性最大。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明細(xì)胞毒性隨抗菌肽濃度先增大后減小,300μg/m L達(dá)到峰值。從而,能夠得到作用于FBL-3原代細(xì)胞的最佳濃度,為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供幫助。家蠅抗菌肽能夠抑殺腫瘤細(xì)胞,得到了再一次的證實(shí)。同時(shí),探索得到了抑制FBL-3細(xì)胞的最佳濃度。家蠅抗菌肽對(duì)非實(shí)體瘤細(xì)胞FBL-3和實(shí)體瘤細(xì)胞MCF-7都有抑殺作用,可通過溶解細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),從而使細(xì)胞凋亡。標(biāo)記FITC的抗菌肽作用FBL-3細(xì)胞,并在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞呈熒光綠。在倒置顯微鏡下,經(jīng)過抗菌肽作用后可看到大量細(xì)胞碎片,而且細(xì)胞膜上出現(xiàn)了裂隙。由此可以推斷,抗菌肽通過細(xì)胞膜作用于腫瘤細(xì)胞,驗(yàn)證了抗菌肽通過破壞細(xì)胞膜抑殺腫瘤細(xì)胞的機(jī)制。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of anti - bacterial peptide on cell growth in C57BL / 6 mice . The results showed that the cytotoxicity of FBL - 3 cells was decreased with the increase of the concentration of antimicrobial peptide .
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-36

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1987521