本文選題：間充質(zhì)干細(xì)胞 + 雙特異性抗體�。� 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：背景和目的:B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin's lymphoma,B-NHL)是一組起源于淋巴結(jié)和其他淋巴組織的惡性腫瘤。傳統(tǒng)治療B-NHL的方法主要包括化學(xué)療法、放射療法以及聯(lián)合利妥昔單抗(Rituximab,美羅華)的多種聯(lián)合化療方案。雖然基于美羅華的抗體靶向治療取得較高的完全緩解率,但在臨床上仍有超過50%患者對(duì)美羅華產(chǎn)生耐藥,導(dǎo)致復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移。隨著B細(xì)胞淋巴瘤表面抗原的發(fā)現(xiàn)以及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,靶向治療B-NHL的研究越來越受到關(guān)注。CD19分子因其表達(dá)于造血干細(xì)胞外的B淋巴細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段,被認(rèn)為是B-NHL中CD20之外的另一個(gè)理想靶點(diǎn)。僅由抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)片段構(gòu)成的微型雙特異性抗體(bispecific antibodies,bsAbs)是繼單克隆抗體之后的一種新型抗體藥物。它通常具有兩個(gè)不同的抗原結(jié)合位點(diǎn),可選擇性募集效應(yīng)細(xì)胞至靶細(xì)胞周圍,從而介導(dǎo)特異性殺傷作用。目前最為有前景的就是已被美國FDA批準(zhǔn)用于治療前B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的雙特異性抗體blinatumomab。雖然blinatumomab在臨床中取得了滿意的療效,但也有其局限性。因其分子量(55 kDa)低于腎小球過濾的閾值,blinatumomab在體內(nèi)的半衰期較短,從而需要長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)輸注,為患者帶來一定程度的不便以及潛在的治療相關(guān)的副作用。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類存在于多種組織、具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞。由于MSCs可以特異地向腫瘤趨化,加上其免疫原性低及易于進(jìn)行基因改造的特點(diǎn),MSCs已成為基因治療的理想載體�；谏鲜霰尘昂屠碚�,本研究探索一種雙重靶向治療系統(tǒng),即利用MSCs向腫瘤部位歸巢的能力,通過基因工程修飾MSCs使其在腫瘤局部表達(dá)并分泌能同時(shí)靶向結(jié)合CD3和CD19抗原的串聯(lián)四價(jià)雙特異性抗體(tetravalent bispecific tandem diabody,TandAb)Tandab(CD3/CD 19)。同時(shí)評(píng)價(jià)此靶向治療系統(tǒng)聯(lián)合使用IDO通路抑制劑1-甲基-D-色胺酸(D-1-methy1-tryptophan,D-1MT)后對(duì)腫瘤的抑制作用。方法:采用PCR、重疊PCR(overlap PCR)、酶切、連接等方法構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體 pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)、pLentiR.SV40-fLuc 和 pLentiR-EV(空載體對(duì)照),經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證其正確性。將慢病毒表達(dá)載體pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,收集培養(yǎng)上清并通過His標(biāo)簽親和層析對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化,通過Western blot檢測(cè)培養(yǎng)上清及純化后樣品中的目的蛋白Tandab(CD3/CD19)。利用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry analysis,FACS)檢測(cè) Tandab(CD3/CD19)與 CD19 陽性細(xì)胞和CD3陽性細(xì)胞的結(jié)合特異性,并通過乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase,LDH)釋放法檢測(cè)Tandab(CD3/CD19)介導(dǎo)的特異性殺傷活性。利用293T細(xì)胞包裝慢病毒顆粒,并感染人臍帶組織來源的MSCs,使其穩(wěn)定表達(dá)Tandab(CD3/CD19)(MSC-Tandab)或者螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase,fLuc)(MSC-Luc)。采用 MTT 法檢測(cè)MSCs經(jīng)慢病毒感染后增殖能力的變化,利用Western blot和ELISA分別檢測(cè)Tandab(CD3/CD19)在MSCs細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及分泌水平。體外利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)研究慢病毒感染對(duì)MSCs向Raji細(xì)胞趨化的影響。體內(nèi)于BALB/c裸鼠上建立CD19陽性Raji淋巴瘤細(xì)胞皮下移植模型,利用生物發(fā)光成像系統(tǒng)觀察MSC-Luc向腫瘤部位的歸巢情況。通過建立共培養(yǎng)殺傷系統(tǒng),利用FACS檢測(cè)MSC分泌的Tandab(CD3/CD19)在體外介導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)CD19陽性的Raji淋巴瘤細(xì)胞的殺傷作用,同時(shí)通過FACS檢測(cè)相互作用后T細(xì)胞活化表面標(biāo)志CD69和CD25的變化,并采用ELISA試劑盒檢測(cè)相互作用后培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子水平。此外,通過聯(lián)合使用D-1MT后于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)對(duì)靶細(xì)胞殺傷;同時(shí)采用比色法測(cè)定培養(yǎng)上清中色氨酸代謝產(chǎn)物犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)的變化以及通過實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)檢測(cè)T細(xì)胞無能相關(guān)基因CD98和Jumonji的表達(dá)變化。在體內(nèi),對(duì)Raji淋巴瘤移植模型聯(lián)合應(yīng)用MSC-Tandab+PBMC和D-1MT進(jìn)行治療,每3天測(cè)量腫瘤直徑和小鼠體重,治療結(jié)束后取瘤組織進(jìn)行稱重,根據(jù)腫瘤重量計(jì)算抑瘤率,評(píng)價(jià)療效。結(jié)果:成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體 pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)、pLentiR.SV40-fLuc及pLentiR-EV,并經(jīng)測(cè)序證明了其基因正確性。質(zhì)粒pLentiR.SV40-Tandab(CD3/CD19)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T后,Westernblot及FACS結(jié)果表明串聯(lián)四價(jià)雙特異性抗體成功表達(dá)于真核細(xì)胞且能特異性結(jié)合CD19陽性細(xì)胞(Raji、Daudi、BJAB)和CD3陽性細(xì)胞(Jurkat),而不與CD19陰性且CD3陰性的K562細(xì)胞結(jié)合。LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明293T表達(dá)的Tandab(CD3/CD19)能夠特異性介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)CD19陽性細(xì)胞的殺傷。成功包裝出慢病毒顆粒LentiR-Tandab(CD3/CD19)、LentiR-EV及LentiR-fLuc。MSCs經(jīng)慢病毒LentiR-Tandab(CD3/CD19)感染后高效表達(dá)目的蛋白Tandab(CD3/CD19),且其增殖能力與體外遷移能力和感染前相比沒有明顯改變。成功建立了 Raji細(xì)胞皮下移植瘤模型,生物發(fā)光成像結(jié)果表明MSC-Luc經(jīng)尾靜脈注射后24 h選擇性地歸巢至腫瘤部位。體外共培養(yǎng)殺傷結(jié)果表明,相互作用24 h后MSC-Tandab分泌的Tandab(CD3/CD19)所介導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷達(dá)到60.6 ± 5.7%,明顯高于對(duì)照組(P0.001)。同時(shí)T細(xì)胞表面活化標(biāo)志CD69和CD25的表達(dá)及細(xì)胞因子(IL-2、IFN-y、TNF-α)的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P0.001)。體外聯(lián)用D-1MT后,共培養(yǎng)48 h和72 h后能明顯提高T細(xì)胞對(duì)Raji細(xì)胞的殺傷(P0.05),而在24h時(shí)沒有明顯差異(P0.05)。雖然相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)上清中Kyn的水平在聯(lián)用D-1MT后基本沒有變化,但T細(xì)胞無能相關(guān)基因CD98和Jumonji的表達(dá)水平在72 h時(shí)明顯降低(P0.001),且T細(xì)胞的增殖能力在48h和72h也得到部分恢復(fù)。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,尾靜脈注射MSC-Tandab+PBMC并聯(lián)用D-1MT對(duì)Raji移植瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。結(jié)論:本課題研究了人UC-MSCs作為一種治療B-NHL的運(yùn)載工具細(xì)胞。從MSCs分泌的Tandab(CD3/CD19)聯(lián)合應(yīng)用D-1MT可以有效地募集T細(xì)胞來抑制Raji細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。研究結(jié)果表明UC-MSCs運(yùn)載基因工程抗體聯(lián)合免疫調(diào)節(jié)藥物可以作為一種臨床中腫瘤基因治療的新策略。
[Abstract]:BACKGROUND & OBJECTIVE : B - cell non - Hodgkin ' s lymphoma ( B - NHL ) is a group of malignant tumors originating from lymph nodes and other lymphoid tissues . The expression of CD69 and CD25 was detected by MTT assay . The expression of CD69 and CD25 was detected by MTT assay . The expression of CD69 and CD25 was detected by MTT assay . In vitro co - culture with D - 1MT , the expression of CD98 and CD25 was significantly lower than that of control group ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R733.1

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本文編號(hào)：1973063