本文選題：非小細胞肺癌 + 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子　； 參考：《山東大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：研究背景肺癌是全球惡性腫瘤死亡的主要原因之一。肺癌分為兩種主要形式：非小細胞肺癌(NSCLC)陽小細胞肺癌,在所有肺癌中分別占到80%和20%。非小細胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病率近年來仍在上升。非小細胞肺癌往往對化療藥物不敏感,因此進一步了解哪些分子能夠促進肺癌生長,存活和轉(zhuǎn)移是非常有意義的。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)素超家族一員,在神經(jīng)系統(tǒng)病理生理學(xué)、神經(jīng)病學(xué)和心理學(xué)的研究中,都顯示出重要功能。最近,一些研究表明,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體TrkB可能參與一些惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,如神經(jīng)母細胞瘤、胰腺導(dǎo)管癌、前列腺癌、肝細胞癌和肺癌等。然而目前在非小細胞肺癌中如何引起TrkB下游信號激活的分子機制尚不清楚。對于治療和預(yù)防包括非小細胞肺癌在內(nèi)的癌癥來說,信號傳感器和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族一直是重要的潛在靶標。信號傳感器和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)被認為通過JAK1或src-激酶來響應(yīng)各種細胞因子和生長因子的調(diào)控。研究表明,在PC12細胞和老鼠的主盆神經(jīng)節(jié)(MPG), STAT3參與介導(dǎo)Trk信號和功能。但STAT3是否作為BDNF/TrkB通路的下游分子在肺癌中起作用仍沒有定論。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),A549細胞中,STAT3信號的激活,促進BDNF產(chǎn)生,激活TrkB信號,進一步促進STAT3的活性,繼而進一步促進BDNF的合成、釋放以及TrkB及其下游信號的激活。研究目的1,探討STAT3活性是否參與A549中TrkB的激活。2,探討B(tài)DNF-TrkB信號是否影響STAT3活性及下游信號。實驗方法1.細胞培養(yǎng)與處理人類的肺腺癌細胞系A(chǔ)549用Dulbecco's modified Eagle's培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)加入10%胎牛血清(Invitrogen)和5mM谷氨酰胺,培養(yǎng)在37℃,飽和濕度,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中。2.蛋白免疫印跡(WB)通過免疫印跡測定目的蛋白質(zhì)的含量。簡言之,等量的蛋白質(zhì)(10μg/每個上樣孔)被SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移到0.22um PVDF膜上(Bio-Rad Inc.)。將膜孵育在封閉液中(0.2mM Tris,137mM Nacl,5%脫脂牛奶以及0.1%Tween-20)一個小時,然后放在4℃抗體中過夜。用TBST緩沖液(0.1% Tween-20, 0.2mM Tris,137mM NaCl)沖洗PVDF膜后,在室溫下孵育HRP--結(jié)合的二抗(1：5000)一個小時,然后進行ECL化學(xué)發(fā)光檢測。3.實時定量PCR反應(yīng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成是通過定量RT-PCR來衡量的。細胞用PBS沖洗后,提取RNA。根據(jù)操作說明用TRNzol-A+RNA提取試劑(TIANGEN)提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄1μg的總RNA和RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒(Fermentas)。實時定量PCR使用SYBR GREEN (Roche)進行(MyiQ2 Bio-Rad)檢測。用2-△△CT方法將每個孔的BDNFmRNA水平標準化。每個實驗重復(fù)三次。4.統(tǒng)計分析顯著性差異統(tǒng)計使用T檢驗和方差分析(方差分析)方法。數(shù)據(jù)顯示用mean±SEM表示,p0.05被認為是有顯著變化的。所有的實驗都重復(fù)三次。結(jié)果1.TrkB在人類肺癌細胞株A549中表達,并存在組成型激活為了檢測TrkB的表達和激活,本實驗用免疫印跡分析(WB)檢測不同條件下A549細胞裂解液。分別用pan-TrkB抗體檢測TrkB蛋白表達,用phospho-Trk抗體檢測激活的TrkB。在肺癌細胞中加入BDNF刺激1h作為陽性對照。結(jié)果顯示,TrkB在A549細胞中存在表達和組成型激活。在A549細胞中,只有145kD的TrkB-FL亞型的表達,沒有TrkB.T1的表達。我們發(fā)現(xiàn),在A549細胞無血清饑餓1h后TrkB磷酸化水平顯著降低,而A549細胞無血清饑餓24小時后TrkB的磷酸化水平又恢復(fù)到饑餓前水平。在血清饑餓的條件下TrkB的磷酸化可以自發(fā)恢復(fù),提示我們可能有配體BDNF自分泌機制的存在。為了確認這種可能性,我們檢測在A549細胞中是否存在BDNF的表達。結(jié)果表明A549存在內(nèi)源性BDNF的表達。這一發(fā)現(xiàn)證明了在A549細胞中BDNF作為主要因素激活TrkB。2.在A549細胞中STAT3轉(zhuǎn)錄因子是BDNF表達的主要影響分子為了研究在無血清的條件下STAT3是否激活,我們進行了免疫印跡分析法測定STAT3磷酸化水平。在A549細胞中,存在Stat3酪氨酸磷酸化以及絲氨酸磷酸化,1h的血清饑餓可以降低STAT3的磷酸化,但24h血清饑餓后,STAT3的磷酸化水平與對照組相比都升高。和Stat3酪氨酸磷酸化相一致的是,特異性的STAT3抑制劑——Sattic預(yù)處理A549,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA和蛋白水平都顯著降低。在無血清條件下,Stat3活性被Sattic抑制能阻斷A549細胞中BDNF在血清饑餓后的自發(fā)恢復(fù)。結(jié)果提示我們,在A549細胞中STAT3影響B(tài)DNF的表達。3.在A549細胞中BDNF是Stat3活性的一個重要的調(diào)節(jié)因子據(jù)先前的研究報道,STAT3同時是BDNF及其受體TrkB的下游信號目標。在A549細胞中,為了研究STAT3活性是否也受BDNF及其受體TrkB調(diào)節(jié),在細胞水平,我們檢測了存在Trk的抑制劑K252a時,STAT3的磷酸化水平。結(jié)果表明,阻斷TrkB活性通路可以顯著減少STAT3的磷酸化水平；而更多的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可能進一步激活STAT3。為了檢測在A549細胞中無血清條件下,STAT3活性的恢復(fù)是否依賴BDNF;我們在無血清條件下加入K252a后處理12 h；此時A549細胞被檢測出STAT3的磷酸化水平低于沒有加入K252a情況。結(jié)果表明,A549細胞在無血清條件下阻斷TrkB活性可能放緩STAT3的自發(fā)恢復(fù)。這一發(fā)現(xiàn)強烈提示,在A549細胞中BDNF增強STAT3活性。4. STAT3誘導(dǎo)的BDNF表達參與Akt蛋白激酶的激活為了檢驗是否STAT3誘導(dǎo)BDNF表達與TrkB及其下游信號通路激活有關(guān),我們檢測了STAT3抑制劑是否影響AKT的活性。AKT是當細胞暴露于凋亡刺激下,重要的反應(yīng)蛋白之一。我們分別加入K252a和Satic抑制劑處理細胞,然后我們檢測Akt蛋白激酶的磷酸化水平。如圖所示,再加入Sattic或K252a處理后,細胞中Akt磷酸化水平減少。結(jié)果表明,BDNF/TrkB和STAT3活性都與Akt蛋白激酶的激活相關(guān)。更重要的是,外源加入K252a不能進一步降低Sattic處理的細胞中Akt蛋白激酶的磷酸化水平。這些結(jié)果證明了STAT3誘導(dǎo)的BDNF表達參與Akt蛋白激酶的激活。討論肺癌是目前全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。在所有肺癌中,非小細胞肺癌(NSCLC)占到80%。而且NSCLC的發(fā)病率幾年來仍在上升。非小細胞肺癌往往對現(xiàn)有化療藥物不敏感,因此進一步了解哪些分子參與了非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展調(diào)控,具有重要的價值。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)素超家族一員,在神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能研究中,都顯示出重要功能。最近,一些研究表明,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體TrkB可能參與一些惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,如神經(jīng)母細胞瘤、胰腺導(dǎo)管癌、前列腺癌、肝細胞癌和肺癌等。然而目前在非小細胞肺癌中如何引起TrkB下游信號激活的分子機制尚不清楚。本研究以非小細胞肺癌中常見的細胞模型——A549細胞為主要研究材料,研究了非小細胞肺癌中,BDNF激活及調(diào)控的機制。本研究主要有以下三個方面的發(fā)現(xiàn)：首先,本研究發(fā)現(xiàn)A549中TrkB的激活可以依賴其自分泌的BDNF實現(xiàn),而不是依賴微環(huán)境中旁分泌的BDNF。而且表明這種BDNF的自分泌調(diào)控,依賴STAT3的活性。以往研究顯示,在非小細胞肺癌中,存在TrkB表達的增加,以及外源加入BDNF可以增加TrkB的活性,及影響下游功能,但沒有研究體內(nèi)情況下,TrkB的激活所需的配體從何而來。本實驗通過RT-PCR及WB實驗,證明A549細胞中,存在BDNF的內(nèi)源性表達,而且這種內(nèi)源性表達的BDNF參與了’TrkB活性的調(diào)控。研究顯示,A549細胞內(nèi),BDNF的調(diào)控受到STAT3的調(diào)控。STAT3在多種腫瘤調(diào)控中起到關(guān)鍵的作用,并且已經(jīng)被報道參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。我們的研究顯示,抑制STAT3的活性,可以顯著減少BDNF的合成,提示STAT3是BDNF合成分泌重要的調(diào)控因子。第二,本研究發(fā)現(xiàn)BDNF/TrkB信號可以進一步上調(diào)STAT3的活性,而這種上調(diào)進一步增加了BDNF的表達及分泌,以及TrkB的激活。我們研究發(fā)現(xiàn),不僅STAT3可以調(diào)控BDNF的合成,BDNF/TrkB活性可以反過來調(diào)控STAT3的活性。而這種BDNF引起的STAT3活性上調(diào),進一步促進了BDNF的合成釋放。這形成了一個典型的正反饋調(diào)控,可能是導(dǎo)致肺癌細胞中STAT3及TrkB活性大量增強的原因之一。第三,本研究發(fā)現(xiàn)這種STAT3依賴BDNF分泌的正反饋調(diào)控,影響了A549細胞中PI3K-AKT信號通路的激活。我們的結(jié)果顯示,在A549中,阻斷STAT3可以引起AKT磷酸化水平的下降,而這種下降不會因為Trk活性的抑制而更低。提示了STAT3對于AKT的活性調(diào)控,可能是由于對BDNF合成的調(diào)控所引起的。也就是說,STAT3依賴的BDNF分泌的正反饋調(diào)控,影響了A549細胞中PI3K-AKT信號通路的激活。研究意義：在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)A549細胞中,BDNF以自分泌方式調(diào)控TrkB激活,并且存在正反饋回路：STAT3信號的激活,促進BDNF產(chǎn)生,激活TrkB信號,而TrkB的激活又進一步促進STAT3的活性,從而促進BDNF的合成、釋放以及TrkB及其下游信號的激活。這種A549細胞自分泌BDNF反饋循環(huán)可能參與了A549生物功能調(diào)控。
[Abstract]:Non - small cell lung cancer ( NSCLC ) has been implicated in the growth and metastasis of lung cancer , such as neuroblastomas , pancreatic ductal carcinoma , prostate cancer , hepatocellular carcinoma and lung cancer . The expression of TrkB was detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) . The results showed that blocking TrkB activity could significantly reduce the phosphorylation level .
However , more brain - derived neurotrophic factors may further activate STAT.To detect the absence of serum - free conditions in A549 cells , it is possible to rely on BDNF to restore the activity recovery .
The results showed that the blocking of TrkB activity by A549 cells in serum - free conditions could slow down the spontaneous recovery of Stat3 . Brain - derived neurotrophic factor ( BDNF ) and its receptor TrkB have been implicated in the development and control of non - small cell lung cancer . In this study , it was found that the positive feedback regulation of the secretion of BDNF in A549 cells could cause a decrease in the phosphorylation level in A549 cells . In other words , the positive feedback regulation of the secretion of BDNF in A549 cells could be caused by the regulation of BDNF synthesis . In other words , the activation of the BDNF secretion stimulated BDNF production , activated the TrkB signal , and the activation of the TrkB further promoted the activation of the TrkB signal pathway . The self - secreted BDNF feedback loop of the BDNF may be involved in the biological function regulation of A549 cells .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：1967435