本文選題：多孔微球 + 阿霉素��； 參考：《吉林大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景： 肺癌，是近年來死亡率最高的癌癥之一，且患病率呈持續(xù)升高的趨勢。隨著肺癌患者的增多，有效治療肺癌的方法成為越來越多科研工作者關(guān)注的焦點(diǎn)與難點(diǎn)。目前，肺癌治療的主要策略是手術(shù)切除、化學(xué)療法和放射療法。我們已經(jīng)知道放射療法雖然具有治療局部損傷的優(yōu)勢，但對(duì)正常組織細(xì)胞中DNA也存在損傷，腫瘤也不易徹底治愈，療效不高；化學(xué)藥物療法存在全身巨大毒副作用，在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，產(chǎn)生的毒副作用給患者帶來痛苦，又因較為昂貴，有些不能做為一線用藥；對(duì)于基因療法（生物療法之一）來說，常被應(yīng)用于放、化療補(bǔ)充或輔助治療之中。阿霉素作為一種重要的非特異性抗腫瘤抗生素被廣泛應(yīng)用于卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、白血病等癌癥的治療，抑癌基因p53因在許多癌癥形成過程中起關(guān)鍵作用，也已被用于頭頸癌、肝癌、卵巢癌等II、III期臨床試驗(yàn)研究中。針對(duì)于肺癌的治療，更多的科研人員正致力于開發(fā)安全、高效、無（低）副作用的肺部原位吸入給藥系統(tǒng)�？晌胧蕉嗫孜⑶蚴瞧渲械囊粋�(gè)研究熱點(diǎn)，迄今主要的載體材料是安全無毒的生物可降解高分子聚合物聚乳酸羥基乙酸（PLGA）。 癌癥是細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡失衡的結(jié)果，腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞凋亡過程受阻，癌細(xì)胞“無限增殖”、肆意橫行，是引發(fā)癌癥的主要原因。在細(xì)胞凋亡的過程中，線粒體扮演著一個(gè)及其重要的角色，它對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、線粒體膜電位的維持都起著至關(guān)重要的作用。 需氧生物細(xì)胞中氧化還原反應(yīng)體系的平衡，是維持正常生理活動(dòng)必需的重要保證，一旦受到內(nèi)外刺激打破體內(nèi)原有的氧化還原平衡時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。伴隨而來，會(huì)產(chǎn)生活性氧等各種類型的自由基。由于機(jī)體存在抗氧化與清除自由基防御體系共筑的五道防線，即細(xì)胞色素氧化酶、抗氧化酶、抗氧化（清除）劑、自由基損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡這五道屏障，體內(nèi)的還原狀態(tài)與能力將對(duì)氧化應(yīng)激進(jìn)行保護(hù)。若腫瘤部位的還原系統(tǒng)遭到破壞，則會(huì)保留氧化應(yīng)激狀態(tài)，使此部位細(xì)胞通過線粒體途徑產(chǎn)生凋亡。 尋找肺癌吸入治療PLGA多孔微球載體，實(shí)現(xiàn)阿霉素與p53抑癌基因的共傳遞是本研究亟待解決的重要問題。阿霉素與p53共傳遞多孔微球能否有效作用于人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，是把握藥物與基因共傳遞多孔微球作為肺癌吸入治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如果該肺癌吸入給藥系統(tǒng)效果較佳，其分子作用機(jī)制是否與活性氧（ROS）介導(dǎo)線粒體細(xì)胞凋亡有關(guān)，是揭示共傳遞肺癌吸入給藥生物功效本質(zhì)的更深入地探索。 目的： 研制針對(duì)肺癌吸入給藥的阿霉素與p53共傳遞多孔微球。 意義： 提供肺癌吸入給藥治療的化學(xué)藥物與抑癌基因協(xié)同效應(yīng)的新方法。 方法： 本文采用PLGA作為載體材料，制備了同時(shí)載有阿霉素和p53-PEI基因納米復(fù)合物的多孔微球——PMS-Dox/p53，建立了阿霉素的液相色譜檢測方法；分析了對(duì)多孔微球的外觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響的諸多因素（致孔劑濃度、PLGA濃度、均質(zhì)轉(zhuǎn)速）；選擇優(yōu)化處方進(jìn)行一系列理化性質(zhì)表征（粒徑、電位、包封率、體外釋放等）。應(yīng)用此處方制備的各組多孔微球（PMS-Dox、PMS-p53、PMS-Dox/p53）觀察對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549作用，檢測了PMS-Dox/p53對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)（細(xì)胞核形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遷移能力）及細(xì)胞凋亡情況的影響。同時(shí)應(yīng)用蛋白免疫印跡法檢測了PMS-Dox/p53對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白因子P53、Caspase3、Caspase8、Caspase9、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)情況的影響，并檢測了Caspase3、Caspase8、Caspase9的活性。進(jìn)一步探討了PMS-Dox/p53組多孔微球使A549細(xì)胞產(chǎn)生凋亡時(shí)，與線粒體途徑相關(guān)因子關(guān)聯(lián)性及其發(fā)生的變化，包括ROS含量、羥自由基含量、線粒體膜電位，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、細(xì)胞色素C細(xì)胞內(nèi)定位及各種抗氧化酶類（劑）活性的影響，探討PMS-Dox/p53多孔微球引起A549細(xì)胞凋亡的分子作用機(jī)制。 結(jié)果： 1.確定了阿霉素的最佳高效液相色譜條件為Ascentis dC18色譜分析柱，流動(dòng)相為0.01M醋酸鈉：甲醇=30:70，冰醋酸調(diào)pH為4.0，檢測波長為254nm。確定了空載多孔微球的最佳處方反應(yīng)制備條件：致孔劑濃度10%，PLGA濃度25%，均質(zhì)轉(zhuǎn)速3000rpm。研制出外形圓整、粒徑均一（約20μm左右）、多孔結(jié)構(gòu)清晰的多孔微球。 2.載入p53-PEI納米復(fù)合物時(shí)PEI與p53質(zhì)粒的質(zhì)量比為0.4。此條件下的p53-PEI納米復(fù)合物具有183.4±90.1nm的粒徑和17.4±9.8mV的電位。 3.成功地同時(shí)將化療藥物阿霉素（Dox）和抑癌基因p53質(zhì)粒載入多孔微球，制備成PMS-Dox/p53。此多孔微球粒徑為22.87±11.79μm并略具正電性。Dox和p53-PEI納米復(fù)合物的包封率分別達(dá)到88.2±1.7%和36.5±7.5%。多孔微球的載體材料安全、無毒、可降解，載藥后可持續(xù)釋放7天，達(dá)到緩、控釋效果。其中，，Dox的釋放要遲于p53-PEI納米復(fù)合物的釋放。 4.各組載藥多孔微球作用于人肺腺癌A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PMS-Dox、PMS-p53、PMS-Dox/p53組多孔微球均使A549細(xì)胞的存活率降低，并可誘導(dǎo)其凋亡。DAPI染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)、結(jié)晶紫染色法觀察細(xì)胞全貌及細(xì)胞劃痕法觀察細(xì)胞遷移率等一系列形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，各載藥組多孔微球均出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、核皺縮、邊緣羽化及遷移能力下降。 5.載藥多孔微球引起A549細(xì)胞凋亡，也引起了一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)水平的改變，包括抑癌基因p53的上調(diào)，促凋亡因子Bax的上調(diào)，Caspase3、Caspase9的上調(diào)、抗凋亡因子Bcl-2的下調(diào)。在對(duì)Caspase3、Caspase8及Caspase9活性的檢測中，Caspase3、Caspase9的活性均有所增加，Caspase8的活性幾乎不變，證實(shí)載藥多孔微球引起A549細(xì)胞凋亡過程可能與線粒體凋亡途徑有關(guān)。 6.檢測與線粒體途徑有關(guān)標(biāo)志性指標(biāo)的變化。發(fā)現(xiàn)載藥多孔微球作用A549細(xì)胞時(shí)，會(huì)引起ROS含量迅速增加，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，抗氧化酶類SOD、CAT、GPx活性均有所降低，同時(shí)抗氧化劑GSH含量下降，細(xì)胞色素C從線粒體釋放進(jìn)入胞漿。表明載藥多孔微球作用A549細(xì)胞確與ROS及線粒體凋亡密切相關(guān)。且以PMS-Dox/p53組多孔微球的作用效果最為明顯，對(duì)肺癌吸入給藥具有極大優(yōu)勢和潛力，推測與化療藥物Dox和抑癌基因p53具有協(xié)同效應(yīng)有關(guān)。 結(jié)論： 根據(jù)多孔微球制備、載藥能力與緩、控釋及對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的影響，主要?jiǎng)?chuàng)新研究結(jié)論為： 1.研制出結(jié)構(gòu)均一、外觀圓整、粒徑20μm、電位為正，包封率達(dá)標(biāo)、適于肺部吸入給藥的共傳遞多孔微球——PMS-Dox/p53。 2.載體骨架材料為生物可降解聚合物PLGA，安全、無毒、且可在體內(nèi)降解、符合肺部給藥要求，可使多孔微球達(dá)到緩釋效果。 3.共傳遞多孔微球PMS-Dox/p53，可抑制A549細(xì)胞存活率，引起A549細(xì)胞凋亡，并使A549細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的因子發(fā)生變化，促凋亡因子上調(diào)，抗凋亡因子下調(diào)，與其他組相比，凋亡效果最明顯。 4.確定ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡通路是共傳遞多孔微球PMS-Dox/p53的分子作用機(jī)制。 綜上所述，本研究制備的PMS-Dox/p53多孔微球，可能為肺癌的治療提供化學(xué)治療與基因治療協(xié)同吸入給藥的新方法。
[Abstract]:Background of Study :

Lung cancer is one of the highest mortality rates in recent years , and the prevalence of lung cancer is increasing continuously . With the increase of lung cancer patients , the method of effective treatment of lung cancer has become the focus and difficulty of more and more researchers .
the chemical medicine therapy has the great toxic and side effect of the whole body , and the toxic and side effects caused by the toxic and side effects caused by the inhibition of the tumor cells can cause pain to the patient , and the medicament is expensive and can not be used as a first - line drug ;
As an important non - specific antitumor antibiotic , it is widely used in the treatment of ovarian cancer , breast cancer , lung cancer , liver cancer , leukemia and other cancers .

Cancer is the result of cell proliferation and cell apoptosis . The cell apoptosis in tumor cells is blocked , and the cancer cell " unlimited proliferation " is the main cause of cancer . In the process of cell apoptosis , mitochondria play an important role , which plays an important role in the maintenance of intracellular calcium ion concentration and mitochondrial membrane potential .

The oxidation - reduction reaction system in aerobic biological cells is an important guarantee for maintaining normal physiological activities . When the internal and external stimuli break the original redox equilibrium in vivo , oxidative stress injury can be generated . As the organism has five barrier lines , such as cytochrome oxidase , antioxidant enzyme , anti - oxidation ( scavenging ) agent , free - radical damage repair and apoptosis , the oxidation stress can be protected . If the reduction system of tumor site is damaged , the state of oxidative stress can be maintained , and the cell can induce apoptosis through the mitochondrial pathway .

It is an important issue to solve the co - transmission of adriamycin with p53 tumor suppressor gene . It is an important issue to solve the problem that the co - transfer of adriamycin and p53 to human lung cancer cell line A549 is a key link in the treatment of lung cancer .

Purpose :

A porous microsphere was developed for the co - delivery of adriamycin and p53 to lung cancer .

Meaning :

a novel method of providing a synergistic effect between a chemical drug for lung cancer inhalation administration and a cancer suppressor gene is provided .

Method :

In this paper , a porous microsphere _ PMS - Dox / p53 containing adriamycin and p53 - PEI gene nanocomposites was prepared by PLGA as a carrier material , and a liquid chromatography detection method for adriamycin was established .
The factors affecting the appearance structure of porous microspheres were analyzed ( pore concentration , PLGA concentration , homogeneous rotation speed ) .
A series of physical and chemical properties ( particle size , potential , encapsulation rate , in vitro release , etc . ) were selected to optimize the prescription . The effects of PMS - Dox / p53 on the morphology of A549 cells ( nuclear morphology , cell migration ability ) and apoptosis of A549 cells were observed by using the porous microspheres ( PMS - Dox , PMS - p53 , PMS - Dox / p53 ) prepared herein . The effects of PMS - Dox / p53 on the expression of apoptosis - related protein factors P53 , Caspase - 3 , Caspase8 , Caspase9 , Bcl - 2 and Bax were detected by Western blot .

Results :

1 . The optimal high performance liquid chromatographic conditions of adriamycin were determined as Ascaris dC18 chromatographic column . The mobile phase was 0.01M sodium acetate : methanol = 30 鈭

本文編號(hào)：1959822