發(fā)布時間：2018-05-29 02:14

  本文選題：地高辛 + 氧化應(yīng)激　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:洋地黃類藥物是臨床治療心律失常和心力衰竭的常用藥物,地高辛是臨床上常用的洋地黃類藥物之一,流行病學(xué)實驗證實,服用洋地黃類藥物的患者復(fù)發(fā)率和死亡率均較低。實驗室的數(shù)據(jù)也證實,洋地黃類藥物可明顯抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長。近年來,氧化應(yīng)激在藥物抗腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注,活性氧可氧化腫瘤細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),引起細(xì)胞損傷,也可作為信號分子參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)控細(xì)胞生長增殖。很多抗腫瘤藥物通過誘導(dǎo)活性氧(ROS)的升高殺傷腫瘤細(xì)胞。本實驗中,我們擬研究氧化應(yīng)激在地高辛抗腫瘤中的作用,并進(jìn)一步探討活性氧的來源以及其作用途徑。方法:采用MTT比色法檢測地高辛對細(xì)胞增殖的影響,用DCFH-DA和dihydroethidium探針標(biāo)記檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧和超氧陰離子的變化,用JC-1試劑盒檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化。用丙二醛(MDA)、谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶活性試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)物質(zhì)含量或活性變化。用流式細(xì)胞術(shù)、電鏡和PI染色檢測地高辛誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的作用。用吖啶橙(AO)染色檢測自噬溶酶體的形成。采用彗星實驗檢測地高辛誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷。用Western blot檢測p-H2A.X蛋白表達(dá)。結(jié)果:1地高辛對不同細(xì)胞生長的抑制作用我們檢測了地高辛對不同細(xì)胞生長的抑制作用,其中對A549細(xì)胞和HCC827細(xì)胞的抑制作用最為明顯,作用24h對A549細(xì)胞生長的IC50為0.21μmol/L。對HCC827細(xì)胞的IC50為0.26μmol/L,對TE-1細(xì)胞的IC50為1.12μmol/L,對MCF-7細(xì)胞和BGC-823細(xì)胞作用最差,對MCF-7細(xì)胞和BGC-823細(xì)胞的IC50為9.18μmol/L和37.14μmol/L。2地高辛通過誘導(dǎo)活性氧升高抑制A549細(xì)胞生長地高辛可明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞活性氧及超氧陰離子升高,并且隨作用時間延長,活性氧含量及超氧陰離子含量逐漸增加,活性氧的升高可引起線粒體膜電位的降低。N-乙酰半胱氨酸(NAC)可完全拮抗地高辛引起的活性氧和超氧陰離子升高及地高辛的抗腫瘤作用,GSH也可部分拮抗地高辛引起的A549細(xì)胞死亡(P0.05或0.01 vs地高辛)。同等濃度的地高辛僅引起TE-1細(xì)胞活性氧的輕度升高,不能引起MCF-7細(xì)胞和BGC-823細(xì)胞活性氧的升高,這與地高辛對這幾種細(xì)胞的生長作用一致。地高辛引起的活性氧的升高早于細(xì)胞內(nèi)鈣升高,因此,地高辛引起的活性氧的升高并不是由于細(xì)胞內(nèi)鈣升高引起的。0.2μmol/L地高辛可抑制細(xì)胞生長,但對腫瘤細(xì)胞Na+/K+-ATPase活性沒有影響,因此,地高辛抑制腫瘤生長作用可能與Na+/K+-ATPase沒有關(guān)系。3地高辛誘導(dǎo)A549細(xì)胞活性氧的升高來源于線粒體和NADPH氧化酶兩條途徑地高辛可引起A549細(xì)胞MDA含量明顯增加(P0.01),GSH/GSSG比值明顯降低(P0.01 vs對照),NADPH氧化酶活性增高(P0.01 vs對照)。NADPH氧化酶抑制劑二聯(lián)苯碘(DPI),線粒體抑制劑魚藤酮和電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅰ阻斷劑環(huán)孢素A(Cs A)可拮抗地高辛的抗腫瘤作用(P0.05或0.01 vs地高辛)。這些結(jié)果提示,活性氧的升高來自線粒體和NADPH氧化酶兩條途徑。4壞死與自噬參與了地高辛誘導(dǎo)的A549細(xì)胞死亡流式和PI染色結(jié)果顯示地高辛可誘導(dǎo)細(xì)胞壞死率明顯增加(P0.01 vs對照),Hoechest33342染色結(jié)果顯示地高辛組細(xì)胞的細(xì)胞核沒有出現(xiàn)凋亡細(xì)胞特有的濃縮,而是呈現(xiàn)空泡化。電鏡下可見地高辛組細(xì)胞核膜破裂,細(xì)胞器溶解,呈現(xiàn)典型的壞死特征。壞死抑制劑necrostatin-1可顯著拮抗地高辛的作用(P0.05或0.01 vs地高辛),而凋亡抑制劑Z-VAD-FMK和Ac-DEVD-CHO對地高辛的抗腫瘤作用沒有影響。吖啶橙染色的結(jié)果顯示地高辛可誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬溶酶體明顯增多,自噬抑制劑3-MA可部分拮抗地高辛的抗腫瘤作用。5地高辛可誘導(dǎo)ROS升高引起A549細(xì)胞DNA損傷彗星實驗的結(jié)果顯示,地高辛可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的拖尾DNA(P0.01 vs對照),免疫組化實驗及western blot結(jié)果均顯示,地高辛可誘導(dǎo)DNA損傷標(biāo)志物p-H2A.X表達(dá)逐漸增加。NAC可拮抗地高辛的作用(P0.01 vs地高辛)。6地高辛通過誘導(dǎo)活性氧升高引起HCC827細(xì)胞壞死和自噬地高辛可誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞活性氧升高,且NAC可拮抗地高辛升高活性氧的作用,也可拮抗地高辛的抗腫瘤作用,提示地高辛誘導(dǎo)的活性氧的升高參與了其誘導(dǎo)的HCC827細(xì)胞的死亡(P0.01 vs對照)。地高辛也可誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞NADPH氧化酶升高,且DPI、Cs A和魚藤酮均可拮抗地高辛的抗腫瘤作用(P0.05或0.01 vs地高辛),提示地高辛誘導(dǎo)的HCC827細(xì)胞活性氧的升高同樣來自線粒體和NADPH氧化酶兩條途徑。流式細(xì)胞儀和電鏡的結(jié)果顯示,地高辛可誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞壞死率明顯增加(P0.01 vs對照),NAC和necrostatin-1可阻斷地高辛的作用(P0.05或0.01 vs地高辛)。地高辛也可誘導(dǎo)HCC827細(xì)胞自噬溶酶體增加,且自噬抑制劑3-MA也可拮抗地高辛的作用(P0.05或0.01 vs地高辛)。結(jié)論1地高辛對不同腫瘤細(xì)胞生長抑制作用有明顯的選擇性,對A549細(xì)胞和HCC827細(xì)胞作用較強(qiáng)。2地高辛通過線粒體和NADPH氧化酶兩條途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞活性氧明顯升高。3地高辛通過誘導(dǎo)活性氧的升高引起腫瘤細(xì)胞DNA損傷、壞死和自噬。
[Abstract]:Objective : To study the effect of digoxin on cell proliferation in vitro and to explore the effect of digoxin on cell proliferation . In recent years , the inhibitory effect of digoxin on cell proliferation was investigated . The increase of active oxygen induced by digoxin was not related to the growth of Na + / K + - ATPase . The inhibitor of NADPH oxidase inhibitor ( DPI ) , mitochondrial inhibitor and electron transport chain complex 鈪，

本文編號：1949106