本文選題：結(jié)腸癌 + 巨噬細(xì)胞��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景組織微環(huán)境與疾病是當(dāng)今生命科學(xué)的熱點領(lǐng)域,腫瘤生物學(xué)、腫瘤免疫學(xué)及干細(xì)胞等醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域研究的飛速發(fā)展,有賴于對特定組織微環(huán)境及其調(diào)控機(jī)制的詮釋。不同的組織微環(huán)境決定其特定細(xì)胞的生物學(xué)功能。組織微環(huán)境由局部的不同細(xì)胞、間質(zhì)及其中的組織間液等成分構(gòu)成,組織微環(huán)境各組分之間具有復(fù)雜的相互調(diào)控作用,最終達(dá)到相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡。受不同生理及病理生理的刺激,組織微環(huán)境的動態(tài)平衡可被打破,構(gòu)成微環(huán)境的組分可發(fā)生變化并改變構(gòu)成細(xì)胞的生物學(xué)特性,參與機(jī)體的許多生理及病理過程與疾病的發(fā)生。如妊娠早期大量免疫細(xì)胞浸潤母體的蛻膜組織,同時局部的細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)譜發(fā)生顯著的改變,此特定組織微環(huán)境的變化是保障妊娠成功的關(guān)鍵之一。而腫瘤發(fā)生過程中構(gòu)成的獨特微環(huán)境,如浸潤的免疫細(xì)胞群體、局部獨特的細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)等,在控制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移及逃逸機(jī)體免疫打擊中起著關(guān)鍵作用。因此,從微環(huán)境概念入手闡述特定微環(huán)境的構(gòu)成及改變的機(jī)制,對特定生物學(xué)行為及相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)歸與治療策略的發(fā)展具有重要意義。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(CSF1)是一種與巨噬細(xì)胞關(guān)系極為密切的多能細(xì)胞因子,在巨噬細(xì)胞的分化、極化和趨化過程中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。目前已在許多類型腫瘤,如乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤等中發(fā)現(xiàn)CSF1及其受體CSFIR局表達(dá),在腫瘤內(nèi)的表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量呈正相關(guān)。結(jié)直腸癌患者外周血CSF1水平約為健康人的兩倍左右,且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤標(biāo)志物(CEA、CA19-9)水平存在相關(guān)性。然而我們尚不清楚促進(jìn)結(jié)直腸癌患者CSF1高度表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制,以及CSF1在結(jié)直腸癌發(fā)展中的意義。結(jié)直腸癌是一種免疫敏感性腫瘤,腫瘤局部浸潤免疫細(xì)胞的數(shù)量及活性與患者預(yù)后密切相關(guān)。其中巨噬細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)中數(shù)量最多的細(xì)胞群體,可達(dá)腫瘤組織細(xì)胞總數(shù)的50%以上。巨噬細(xì)胞具有造血系統(tǒng)中最強(qiáng)的可塑性,根據(jù)外界環(huán)境因素可分化為抑瘤或促瘤兩種功能相反的細(xì)胞亞群。結(jié)直腸癌浸潤的巨噬細(xì)胞是否對腫瘤局部CSF1水平起調(diào)節(jié)作用?CSF1是否通過影響巨噬細(xì)胞功能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展?基于以上問題,我們探究了結(jié)腸癌患者中CSF1的表達(dá)及其臨床意義,并分析了結(jié)腸癌局部高CSF1微環(huán)境形成的調(diào)節(jié)機(jī)制。在此觀察結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用體外實驗和動物模型進(jìn)一步探究腫瘤高CSF1微環(huán)境對巨噬細(xì)胞遷移和細(xì)胞因子分泌等生物學(xué)功能的影響。此外,我們發(fā)現(xiàn)褐藻多糖影響CSF1在巨噬細(xì)胞中的自分泌過程,從而對巨噬細(xì)胞的生物學(xué)活性產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。這將可能為CSF1介導(dǎo)的抗腫瘤免疫治療提供新的輔助治療手段。妊娠早期蛻膜具有與腫瘤微環(huán)境相似的生物學(xué)特性,不僅存在多種類型的免疫細(xì)胞浸潤和“免疫赦免”狀態(tài),還具有與腫瘤相似的高度侵襲活性。絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous cytotrophoblasts, EVT)是微環(huán)境中發(fā)揮主要侵襲作用的細(xì)胞類型,但其侵襲活性受到嚴(yán)格的時間和空間限制。多種激素水平的變化是妊娠早期蛻膜微環(huán)境的顯著特征之一,瘦素即為其中一種重要的妊娠相關(guān)激素。蛻膜組織中的多種類型細(xì)胞均分泌瘦素,妊娠早期機(jī)體外周血及妊娠局部瘦素水平顯著升高。高瘦素狀態(tài)是胚胎正常植入和妊娠維持的關(guān)鍵。妊娠早期EVT細(xì)胞高度表達(dá)瘦素受體,提示瘦素可能對其生物學(xué)行為發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。為明確瘦素與妊娠早期蛻膜微環(huán)境高度侵襲特性之間的聯(lián)系,我們利用體外實驗?zāi)M高瘦素微環(huán)境,并探究了外源性瘦素對人妊娠早期EVT細(xì)胞系侵襲活性的影響及其相關(guān)作用機(jī)制。本課題選取了結(jié)腸癌及妊娠早期蛻膜這兩個典型的病理或生理組織微環(huán)境作為研究對象,以探究結(jié)腸癌局部高CSF1微環(huán)境的形成機(jī)制,以及CSF1和瘦素對組織微環(huán)境中巨噬細(xì)胞和EVT細(xì)胞的侵襲、遷移、分化等多種生物學(xué)行為的影響。我們的研究為理解微環(huán)境構(gòu)成和各組分間的相互調(diào)節(jié)作用提供了有價值的補(bǔ)充,有助于從以微環(huán)境為基礎(chǔ)的創(chuàng)新角度入手,闡述特定生理現(xiàn)象或疾病進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制。第—部分結(jié)腸癌來源的巨噬細(xì)胞集落刺激因子對結(jié)腸癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞相互作用的影響及相關(guān)機(jī)制目的腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞是結(jié)直腸癌患者免疫療法的潛在靶點。巨噬細(xì)胞集落刺激因子(CSF1)在巨噬細(xì)胞的募集和功能發(fā)揮中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,但其在結(jié)腸癌局部的表達(dá)及在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍未闡明。本研究將探討結(jié)腸癌高CSF1微環(huán)境的形成機(jī)制,以及腫瘤來源的CSF1對結(jié)腸癌細(xì)胞與腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞相互作用的影響。此外,本研究還探討了天然提取物褐藻多糖對巨噬細(xì)胞CSF1自分泌過程的影響,及CSF1自分泌對巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)作用。方法1.通過免疫組化檢測分析CSF1和CD68(巨噬細(xì)胞)在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及與結(jié)腸癌患者疾病狀態(tài)和預(yù)后的相關(guān)性。2.利用transwell小室構(gòu)建結(jié)腸癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞體外間接共培養(yǎng)模型。采用qRT-PCR、ELISA等方法檢測共培養(yǎng)對結(jié)腸癌細(xì)胞CSF1表達(dá)的影響。3.采用qRT-PCR、ELISA. Western blotting等方法檢測巨噬細(xì)胞分泌的IL-8對結(jié)腸癌細(xì)胞CSF1表達(dá)的影響和相關(guān)信號通路。4.采用transwell小室及qRT-PCR等技術(shù)檢測結(jié)腸癌細(xì)胞分泌的CSF1對巨噬細(xì)胞募集和分泌活性的影響。5.建立裸鼠結(jié)腸癌CSF1過表達(dá)移植瘤模型。利用體內(nèi)實驗探究腫瘤來源CSF1對結(jié)腸癌發(fā)展和巨噬細(xì)胞浸潤的影響。6.探究自然提取物褐藻多糖對巨噬細(xì)胞遷移活性和細(xì)胞因子分泌的影響。7.采用qRT-PCR及ELISA等方法檢測褐藻多糖對巨噬細(xì)胞CSF1分泌的影響,并分析巨噬細(xì)胞分泌的CSF1對自身遷移和細(xì)胞因子分泌功能的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果顯示,與癌旁組織或正常腺體組織相比結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞CSF 1表達(dá)水平明顯增高。結(jié)腸癌及癌旁基質(zhì)中CD68+細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)數(shù)量顯著多于正常結(jié)腸組織。CSF1高表達(dá)及巨噬細(xì)胞浸潤與患者的腫瘤分期有關(guān),是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立因素。2.與巨噬細(xì)胞間接共培養(yǎng)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞CSF1的表達(dá)。3.巨噬細(xì)胞分泌大量的IL-8,促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞CSF1的表達(dá)和PKC信號通路的磷酸化水平。PKC信號通路的活化可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞CSF1的表達(dá)。4.結(jié)腸癌細(xì)胞分泌的CSF1顯著促進(jìn)對巨噬細(xì)胞的募集,并調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分泌因子表達(dá)譜,抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)而促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。5.裸鼠移植瘤模型中結(jié)腸癌細(xì)胞CSF1過表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤并抑制移植瘤生長。6.巨噬細(xì)胞分化過程中加入褐藻多糖,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,遷移能力和促炎細(xì)胞因子的分泌活性受到抑制。7.褐藻多糖劑量依賴性抑制巨噬細(xì)胞CSF1的分泌。外源性CSF1顯著減弱褐藻多糖對巨噬細(xì)胞遷移和分泌功能的抑制作用。結(jié)論我們的研究分析了結(jié)腸癌高CSF1微環(huán)境形成的機(jī)制及在結(jié)腸癌發(fā)展中的關(guān)系,并首次證實CSF1是結(jié)腸癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞相互作用環(huán)路中的關(guān)鍵因子。結(jié)腸癌局部的CSF1不僅影響腫瘤浸潤巨噬細(xì)胞的侵襲和分化,更影響整個腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài),有希望成為結(jié)腸癌治療中新的作用靶點。此外,我們發(fā)現(xiàn)CSF1在巨噬細(xì)胞中的分泌可通過外源性加入自然提取物褐藻多糖進(jìn)行調(diào)節(jié),以此改變機(jī)體的免疫細(xì)胞狀態(tài)和免疫功能。這提示以CSF1為基礎(chǔ)的免疫療法可能在多種疾病如腫瘤的治療中發(fā)揮重要的輔助作用。第二部分瘦素對入妊娠早期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲活性的調(diào)節(jié)及相關(guān)機(jī)制研究目的人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(extravillous cytotrophoblasts, EVT)的侵襲活性受到嚴(yán)格的時間和空間限制。妊娠早期機(jī)體外周血瘦素水平顯著升高,是胚胎正常植入和妊娠維持的關(guān)鍵因素。但高瘦素狀態(tài)對EVT細(xì)胞的侵襲有何作用目前尚不清楚。本研究利用體外實驗,探究瘦素對人妊娠早期EVT細(xì)胞侵襲活性的調(diào)節(jié),并探究可能的作用機(jī)制。方法1.采用transwell小室研究瘦素對人EVT細(xì)胞系侵襲活性的影響。2.采用qRT-PCR, Western blotting等方法研究瘦素對人EVT細(xì)胞系MMP14表達(dá)的影響。向人EVT細(xì)胞系轉(zhuǎn)染MMP14 siRNA干擾其表達(dá)。通過transwell小室研究MMP14在瘦素調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲活性中的作用。3.采用qRT-PCR、Western blotting等技術(shù),探究瘦素對滋養(yǎng)細(xì)胞Notch1信號通路活性的影響。4.向人EVT細(xì)胞系轉(zhuǎn)染Notch1 siRNA干擾其表達(dá),研究Notch1對滋養(yǎng)細(xì)胞MMP14表達(dá)的影響。利用transwell小室研究Notch1在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲活性中的作用。5.通過Western blotting技術(shù)研究瘦素及Notch1受體對PI3K信號通路活性的影響,以及PI3K信號通路在滋養(yǎng)細(xì)胞MMP14表達(dá)中的作用。結(jié)果1.瘦素促進(jìn)人EVT細(xì)胞系的侵襲和MMP14的表達(dá),MMP14參與瘦素調(diào)節(jié)的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程。2.瘦素促進(jìn)EVT細(xì)胞Notch1信號通路的活性�；罨腘otch1信號通路參與瘦素調(diào)節(jié)的滋養(yǎng)細(xì)胞MMP14表達(dá)和侵襲過程。3. Notch1信號通路參與瘦素對滋養(yǎng)細(xì)胞中PI3K信號通路的激活作用�；罨腜I3K信號通路調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP14的表達(dá)結(jié)論在此研究中,我們發(fā)現(xiàn)瘦素通過Notch1-PI3K-MMP14通路促進(jìn)人EVT細(xì)胞系的侵襲活性。這一發(fā)現(xiàn)將為瘦素在妊娠早期蛻膜微環(huán)境中的生理功能及其作用機(jī)制提供有力補(bǔ)充,提示瘦素可能在子癇或腫瘤等侵襲異常相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展與防治工作中發(fā)揮重要作用。小結(jié)腫瘤和妊娠局部均存在特殊的組織微環(huán)境,微環(huán)境中的局部免疫狀態(tài)、細(xì)胞運動活性等多項生物學(xué)特性具有很大的相似之處。我們的研究選取了結(jié)腸癌和妊娠早期蛻膜這兩個典型的病理或生理組織微環(huán)境,探究了組織局部CSF1過表達(dá)微環(huán)境形成的機(jī)制,以及高CSF1及高瘦素微環(huán)境對組織內(nèi)部巨噬細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞等特殊細(xì)胞群體多種生物學(xué)行為的影響。探究生理及病理微環(huán)境中各組分間的調(diào)節(jié)機(jī)制并比較其異同之處,對理解組織局部特定生物學(xué)行為及相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)歸具有重要意義,并有助于為新型治療手段的開發(fā)提供靈感。
[Abstract]:In this paper , the expression of CSF1 and its receptor ( CSFIR ) have been studied in many types of tumors , such as breast cancer , liver cancer , glioma , etc . In this study , the effects of exogenous leptin on the invasion , migration and differentiation of macrophage in human colon cancer cells were investigated . The effects of CSF1 on macrophage migration and cytokine secretion in colon cancer cells were studied by means of transwell cell and qRT - PCR . In this study , we find that leptin may play an important role in the development and prevention of abnormal cell populations such as colon cancer and early pregnancy .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35
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本文編號：1936117