本文選題：RBP2 + YAP1�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景白血病是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。在骨髓和其他造血組織中,白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化為成熟細(xì)胞的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。根據(jù)疾病的病程分為急性和慢性兩大類。急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, AL L)是一組起源于淋巴細(xì)胞(B系或T系)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病,其特征為大量未成熟的淋巴細(xì)胞在骨髓中異常增生并聚集進(jìn)而抑制正常造血。急性淋巴細(xì)胞白血病(簡稱急淋)在成人及兒童中均可發(fā)病,其發(fā)病高峰在2-5歲。近年來,聯(lián)合化療的應(yīng)用使得兒童急淋的治愈率高達(dá)80%以上,但成人急淋的預(yù)后仍較差,緩解后極易復(fù)發(fā)。急性淋巴細(xì)胞白血病是一種異質(zhì)性疾病,研究表明遺傳學(xué)改變與急淋發(fā)生相關(guān),最近研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)改變在急淋發(fā)生中也發(fā)揮重要作用。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白2(retinoblastoma binding protein-2, RBP2)又稱作KDM5A或JARID1A,是JARID家族成員之一,具有組蛋白去甲基化酶的活性。RBP2可以使組蛋白H3上具有三甲基化和二甲基化標(biāo)記的的第四位賴氨酸K4 (H3-K4)發(fā)生去甲基化。研究表明,RBP2可以通過影響細(xì)胞的增殖、衰老、分化在胃癌、肝癌及肺癌等實(shí)體瘤中促進(jìn)腫瘤發(fā)生、EMT及侵襲轉(zhuǎn)移等。然而,RBP2在血液系統(tǒng)疾病中的研究較少,我們的前期研究表明RBP2在慢性粒細(xì)胞性白血病急變中發(fā)揮抑癌作用。因此,RBP2在人類腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮了促癌及抑癌的雙重作用。RBP2是否在ALL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用仍不清楚。慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是以脾大、貧血和粒細(xì)胞增多為特征的骨髓增殖性疾病。人類9號和22號染色體易位t(9;22)(q34;q11)形成BCR-ABL融合基因,編碼具有高度酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白介導(dǎo)慢粒發(fā)生。CML的疾病進(jìn)程分為三個(gè)階段：慢性期(CP)、加速期(AP)和急變期(BP)。酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是目前CML的一線治療方案,主要包括第一代TKI伊馬替尼,第二代TKI達(dá)沙替尼和尼羅替尼和第三代TKI普納替尼等,TKIs對慢性期慢粒治療效果好。然而,仍有約15%-20%的慢性期患者進(jìn)展到急變期,還有10%-15%的患者初診時(shí)已處于進(jìn)展期。CML一旦急變,酪氨酸激酶抑制劑、化療或兩者聯(lián)合使用均療效差,病情兇險(xiǎn),預(yù)后極差。融合基因BCR-ABL的形成是CML發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素,然而慢粒急變發(fā)生的分子學(xué)機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),在CML急變演進(jìn)過程中BCR-ABL仍然發(fā)揮了重要的作用。與此同時(shí),許多研究還表明BCR-ABL非依賴的機(jī)制,如抑癌基因的失活以及促癌基因的激活等在CML急變中同樣發(fā)揮了極其重要的作用。Yes相關(guān)蛋白1 (Yes-associated protein 1,YAP1)是Hippo通路中的重要分子,在發(fā)育過程及腫瘤發(fā)生中都發(fā)揮了重要作用。AP1主要與TEAD家族等轉(zhuǎn)錄激活基因結(jié)合進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。YAP1在腫瘤中的作用存在爭議,胃癌、肺癌以及肝癌中YAP1發(fā)揮促癌作用,而在結(jié)腸癌、乳腺癌以及多發(fā)性骨髓瘤中YAP1被證實(shí)可與PML、P73結(jié)合促進(jìn)促凋亡基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。因此,YAP1在人類腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮促癌或抑癌作用,主要取決于組織的特異性。然而,YAP1在CML急變中的表達(dá)情況及作用尚不清楚。研究目的(一)探討RBP2在成人急性淋巴細(xì)胞白血病中的作用和機(jī)制。(二)探討YAP1在慢粒急變中的作用及機(jī)制。方法和結(jié)果(一)組蛋白去甲基化酶RBP2上調(diào)BCL2促進(jìn)成人急性淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生1.RBP2在急性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)升高：我們收集了42例初診(ALL-denovo)、36例完全緩解(ALL-CR)、9例復(fù)發(fā)(ALL-relapse)的成人ALL患者以及33例缺鐵性貧血病人(con)的骨髓樣本。免疫熒光(IF)、Western Blot及qRT-PC R檢測了RBP2的表達(dá)情況,結(jié)果顯示：與對照組相比,初診ALL的患者骨髓標(biāo)本中RBP2的mRNA及蛋白水平升高約2倍；當(dāng)治療后達(dá)到完全緩解時(shí)RBP2的表達(dá)降低；疾病復(fù)發(fā)后RBP2表達(dá)又進(jìn)一步升高,約為對照組的5倍。觀察4例ALL患者在疾病進(jìn)展過程中RBP2的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)3例患者在疾病完全緩解后RBP2的表達(dá)與初診時(shí)相比均有明顯下降。2.RBP2敲除促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖：用RBP2-siRNA及RBP2-shRNA干擾急淋白血病細(xì)胞系RBP2的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示細(xì)胞凋亡明顯增加,克隆形成及EdU實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞增殖明顯抑制。3.BCL2是RBP2的靶基因：用qRT-PCR及Western Blot方法發(fā)現(xiàn)急淋細(xì)胞系中干擾RBP2可以下調(diào)BCL2的mRNA水平及蛋白表達(dá)；干擾ALL患者骨髓原代細(xì)胞RBP2后BCL2的表達(dá)亦明顯下調(diào)；同步檢測ALL患者骨髓標(biāo)本中RBP2及BCL2表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)呈現(xiàn)明顯正相關(guān)。這些結(jié)果表明BCL2是RBP2的重要靶基因。進(jìn)一步用雙熒光素酶活性檢測證實(shí)了干擾RBP2可以使BCL2啟動(dòng)子活性下降。CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RBP2可以結(jié)合于BCL2啟動(dòng)子的b區(qū)域,而不能與a或c區(qū)域結(jié)合。4.RBP2調(diào)控凋亡和增殖依賴于對BCL2的調(diào)控：將BCL2高表達(dá)后,RBP2敲除所誘導(dǎo)的凋亡增加及增殖抑制被部分逆轉(zhuǎn)；RBP2敲除與BCL2抑制劑ABT-199聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞凋亡明顯增加,表明兩者具有協(xié)同抗白血病效應(yīng)。(二)YAP1調(diào)控PDCD4在慢粒急變中發(fā)揮抑癌作用1.YAP1在CML急變中低表達(dá)：通過對GEO數(shù)據(jù)庫中CML芯片結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)CML急變期病人中YAP1的表達(dá)比慢性期降低50%左右；qRT-PCR及免疫熒光檢測38例CML慢性期以及21例急變期病人骨髓標(biāo)本中的YAP1的表達(dá),證實(shí)了CML急變過程中YAP1的表達(dá)較慢性期明顯降低,mRNA水平較慢性期降低了約65%。2.YAP1促進(jìn)慢粒急變細(xì)胞凋亡和分化：細(xì)胞水平研究,用EdU和流式細(xì)胞術(shù)檢測觀察到Y(jié)AP1高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長；并且可以促進(jìn)Bax、P21等P73下游基因的表達(dá)。用誘導(dǎo)分化劑PMA誘導(dǎo)CML細(xì)胞系K562及MEG-01向巨核系分化后,YAP1的表達(dá)顯著升高；將YAP1高表達(dá)后巨核系分化標(biāo)志CD61表達(dá)明顯增加,并且與PMA具有協(xié)同誘導(dǎo)CML細(xì)胞分化的能力。3.YAP1調(diào)控PDCD4的表達(dá)：qRT-PCR和Western Blot檢測YAP1高表達(dá)后下游基因的表達(dá),結(jié)果顯示YAP1可以調(diào)控CML急變過程中參與細(xì)胞分化的重要分子PDCD4而不影響B(tài)CR-ABL的表達(dá)。4.YAP1在CML急變中受到表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控：DNA甲基化抑制劑地西他濱(decitabine)以及組蛋白去乙�；�(HDAC)抑制劑西達(dá)本胺(chidabine)處理慢粒急變細(xì)胞后,YAP1表達(dá)升高。因此,YAP1可能受到表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控。研究結(jié)論本文通過對RBP2及YAP1這兩個(gè)具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的分子在成人白血病中的研究發(fā)現(xiàn)：RBP2在ALL發(fā)生及發(fā)展過程中通過調(diào)控BCL2發(fā)揮促癌作用；YAP1在CML急變過程中表達(dá)降低,通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化發(fā)揮了抑癌作用。這些發(fā)現(xiàn)表明RBP2及YAP1的異常表達(dá)對于疾病的診斷有提示意義,可作為白血病診斷、治療及監(jiān)測疾病進(jìn)展的潛在靶點(diǎn)。
[Abstract]:In recent years , it has been shown that RBP2 plays an important role in the pathogenesis of acute lymphoblastic leukemia . In this study , it was found that BCR - ABL plays an important role in the pathogenesis of acute lymphoblastic leukemia .
RBP2 expression was decreased when complete remission was achieved after treatment .
The expression of RBP2 was further increased after the disease recurrence . The expression of RBP2 was observed in 4 ALL patients . The expression of RBP2 was significantly decreased in 4 ALL patients .
The expression of BCL2 in bone marrow primary cells of patients with disturbance ALL was also down - regulated .
The results showed that BCL2 was an important target gene for RBP2 . The results showed that BCL2 was an important target gene for RBP2 . The results showed that RBP2 could bind to the b region of BCL2 promoter , but could not bind to a or c region .
( 2 ) The expression of YAP1 was reduced by 50 % compared with the chronic phase by analyzing the results of CML chip in GEO database .
The expression of YAP1 was detected by qRT - PCR and immunofluorescence in 38 CML patients with CML and 21 cases of acute phase change .
and the expression of Bax , P21 and other P73 downstream genes can be promoted .
The expression of the downstream gene was regulated by the expression of YAP1 and Western Blot . The results showed that YAP1 could regulate the expression of PDCD4 in CML cells . The results showed that YAP1 could regulate the expression of the downstream gene in CML cells .
These findings suggest that the abnormal expression of RBP2 and YAP1 can be used as a potential target for the diagnosis , treatment and monitoring of the disease .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7

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本文編號：1935389