肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,具有發(fā)病隱匿的特點,被診斷時往往已經到了中晚期,治療的預后效果較差。因此,肝癌的早期診斷及病情程度判定對于該病的防治及預后具有重要的臨床意義。而代謝組學作為系統生物學的新興方向,其主要是基于高靈敏、高通量的分析手段對生物體受擾動后的內源性小分子代謝產物的整體變化輪廓進行表征,具有靈敏、系統、動態(tài)的研究特點。為此,本研究應用液相色譜-質譜聯用技術(liquid chromatography coupled to mass spectrometry,LC-MS)對肝癌血清及組織樣本采集代謝輪廓數據,并利用單變量及多變量分析方法獲得穩(wěn)定可靠的血清診斷性代謝產物。在此基礎上,利用代謝通路及網絡分析結合細胞及分子生物學技術對相關機制進行初步探究。研究首先利用LC-MS技術分析獲得299例肝癌及320例對照組血清代謝輪廓的高通量數據,利用主成分分析(principal components analysis,PCA)、偏最小二乘-判別分析(partial least square discriminant analysis,PLS-DA)模型分析了肝癌及對照組間的代謝輪廓。通過輪廓比對分析得出兩組代謝組學數據存在差異,PCA結果顯示檢測結果的穩(wěn)定性,PLS-DA分析結果顯示兩組具有顯著性差異,進而利用隨機森林法獲得87個組間差異性代謝產物。在外部驗證數據集中,利用Logistic回歸、Pearson相關性分析及受試者工作曲線(receiver operating characteristic,ROC)篩選得到D-半乳糖等可用于診斷的代謝標志物。這些標志物與甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)聯合診斷的靈敏度、特異度及單變量曲線下面積(area under the curve,AUC)分別為0.96、0.92、0.98,且將聯合指標用于樣本集中AFP陰性樣本的預測,可以達到準確率78%,這一結果大大提高了AFP的診斷效能。而對于58例TNM I期樣本,以上物質聯合診斷的單變量AUC也可以達到0.96,提示其對于早期肝癌也具有較好的判定效果。此外,結合型膽酸具有一定的分期相關的變化趨勢,呈現出一定的早期診斷潛能。進一步針對87個差異性代謝產物開展了代謝通路分析及網絡分析,發(fā)現脂酰肉堿呈現出側鏈長度及不飽和度的聚簇及遞變規(guī)律,為相關機制研究提供參考。為了探討血清中差異性代謝產物與肝癌組織中差異性代謝物的關系,本研究還展開了肝癌組織代謝輪廓分析。研究首先建立了基于LC-MS的肝癌代謝組學樣本處理及分析方法,并獲得80對肝癌及癌旁組織極性組分的代謝輪廓。PLS-DA模型表明肝癌及癌旁組織極性代謝輪廓具有顯著差異。進一步利用正交隱變量投影-判別分析(orthogonal projection to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA)模型獲得29個可以表征肝癌及癌旁組織間差異的極性差異性代謝產物。通過血清與組織極性代謝輪廓的對比,發(fā)現了4個血清-組織共有差異性代謝產物:C14脂酰肉堿、L-酪氨酸、溶血性卵磷脂Lyso PC(18:2)及L-谷氨酸鹽,并發(fā)現其在組織及血清中的變化趨勢均相同。此外,結合型膽酸被發(fā)現在組織中的變化趨勢與血清中相反且具有顯著性相關,提示血清中結合型膽酸的變化可能源于肝癌組織。結合上述研究分析發(fā)現,肝癌樣本的中短鏈脂酰肉堿降低及長鏈脂酰肉堿升高的趨勢在血清及組織極性代謝輪廓存在一致性改變。為進一步系統探究該趨勢的變化規(guī)律及相關機制,本研究利用代謝靶標分析方法考察了80對肝癌及癌旁組織中不同類型的26個脂酰肉堿的變化趨勢,并結合定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)等分子生物學技術表征和驗證了肝癌組織細胞中介導脂酰肉堿合成及分解的肉毒堿棕櫚酰轉移酶(carnitine palmitoyltransferase,CPT)的表達。結果顯示,CPT1A在肝癌及癌旁組織間的m RNA表達沒有區(qū)別,而CPT2在肝癌組織中的m RNA及蛋白的表達均顯著低于癌旁組織,提示CPT2酶的表達降低是導致不同長度脂酰肉堿相對變化的誘因之一。為此,本研究構建了BEL-7402/CPT2-knockdown細胞株,并利用代謝靶標分析發(fā)現相對于陰性對照細胞,CPT2-knockdown細胞株中的中短鏈脂酰肉堿降低且長鏈脂酰肉堿升高,該趨勢與組織中的脂酰肉堿變化趨勢一致。以上結果表明CPT2的表達降低是導致不同長度脂酰肉堿相對變化的誘因之一。除對肝癌組織極性組分代謝輪廓開展分析之外,本研究進一步優(yōu)化脂質組學分析方法,系統地表征了肝癌組織脂質代謝輪廓的變化及其規(guī)律。研究利用優(yōu)化后的LC-MS技術獲得高通量肝癌脂質組數據,應用PLS-DA模型考察了肝癌及癌旁組織整體及不同類型脂質代謝輪廓的差異,并最終鑒定了113個差異性脂質分子。隨后,利用代謝拓撲分析篩選變化顯著的脂質代謝通路,結果發(fā)現甘油磷脂代謝、甘油脂質代謝及鞘脂代謝三個通路呈現出顯著性改變,其變量(差異代謝物)在通路中具有重要調控意義(Impact大于0.1),覆蓋率p值小于0.05。此結果提示,這三個通路中的代謝酶在肝癌組織中呈現出顯著性變化。進一步結果顯示,磷脂酰乙醇胺及磷脂酰絲氨酸在肝癌組織中分別呈現降低及升高的趨勢,與甘油磷脂代謝通路中介導二者轉化的磷脂酰絲氨酸合成酶2(phosphatidylserine synthase 2,PTDSS2)在肝癌中的m RNA表達升高相符。同理,甘油三酯的降低與甘油二酯的升高也與脂蛋白酯酶(lipoprteinlipase,LPL)的表達及酶活性的升高相符,表明了上述代謝通路中確實存在代謝酶的改變,同時也提示LPL的表達升高是導致甘油二酯(diacylglycerol,DG)與甘油三酯(triacylglycerol,TG)轉化失衡的原因。而DG則是磷磷脂酰肌醇細胞信號通路中的關鍵分子,被定義為第二信使,在腫瘤細胞信號轉導中具有重要的意義。綜上所述,本文利用代謝組學的研究策略篩選了具有較好臨床診斷效能的潛在血清代謝標志物;同時還基于組織代謝組學技術平臺,結合細胞及分子生物學手段初步探討了肝癌組織脂酰肉堿相關變化的機制;并利用脂質組學策略結合代謝通路及拓撲分析探究了肝癌組織脂質代謝輪廓及相關通路的變化規(guī)律。因此,本研究為肝癌的臨床診斷及相關病理機制研究提供價值信息。
【學位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
文章目錄
摘要
Abstract
縮略語表
第1章 緒論
1.1 課題背景及研究的目的與意義
1.2 肝癌及其研究進展
1.2.1 肝癌的現狀
1.2.2 肝癌的診斷及生物標記物
1.3 代謝組學及其研究進展
1.3.1 基本概述
1.3.2 樣本的采集及制備
1.3.3 分析技術
1.3.4 數據分析
1.3.5 數據庫
1.4 肝癌代謝組學的研究進展
1.4.1 代謝生物標志物的研究現狀
1.4.2 代謝通路研究現狀
1.5 本課題的主要內容和技術路線
1.5.1 研究內容
1.5.2 技術路線
第2章 實驗材料與方法
2.1 實驗材料
2.1.1 臨床樣本
2.1.2 細胞系
2.1.3 引物及干擾序列
2.1.4 抗體
2.1.5 各類其它實驗試劑
2.1.6 實驗儀器
2.2 實驗方法
2.2.1 血清樣本的制備
2.2.2 組織樣本的制備
2.2.3 細胞培養(yǎng)及制備
2.2.4 代謝組學數據采集
2.2.5 數據預處理
2.2.6 統計分析
2.2.7 化合物鑒定
2.2.8 實時定量PCR
2.2.9 RNA干擾實驗
2.2.10 Western blot
第3章 肝癌血清代謝輪廓分析及生物標志物的篩選
3.1 引言
3.2 血清代謝組學技術平臺的建立
3.2.1 樣本前處理方法的建立
3.2.2 LC-Q/TOF-MS分析方法的建立
3.3 代謝輪廓分析
3.3.1 代謝輪廓LC-MS譜圖獲得及比較
3.3.2 主成分分析
3.3.3 偏最小二乘判別分析
3.4 差異性代謝產物的篩選及鑒定
3.4.1 顯著性差異離子特征的篩選
3.4.2 差異性代謝產物的篩選
3.5 診斷代謝生物標記物的篩選及驗證
3.5.1 診斷代謝生物標志物的篩選
3.5.2 聯合診斷分析
3.6 病理分期相關代謝輪廓分析及其代謝產物的篩選
3.7 代謝通路分析
3.8 相關網絡分析
3.9 本章小結
第4章 肝癌及癌旁組織代謝輪廓對比分析
4.1 引言
4.2 組織代謝組學技術平臺的建立
4.2.1 樣本前處理方法的建立
4.2.2 LC-Q/TOF-MS分析方法的建立
4.3 極性組分代謝輪廓分析
4.3.1 LC-MS譜圖比較
4.3.2 偏最小二乘判別分析
4.4 極性差異性代謝產物的篩選及臨床混雜因素的影響
4.4.1 極性差異性代謝產物的篩選
4.4.2 臨床混雜因素的影響
4.5 組織極性與血清差異性代謝產物的對比
4.5.1 組織與血清共有差異性代謝產物的篩選及分析
4.5.2 血清差異性代謝產物在組織中的差異性分析
4.6 代謝拓撲及通路分析
4.6.1 代謝拓撲分析
4.6.2 代謝通路分析
4.7 本章小結
第5章 肝癌脂酰肉堿代謝輪廓變化及其機制研究
5.1 引言
5.2 組織脂酰肉堿代謝靶標分析及其對比研究
5.2.1 脂酰肉堿代謝靶標分析
5.2.2 脂酰肉堿對比研究
5.3 脂酰肉堿相關網絡及相關熱圖分析
5.3.1 相關網絡分析
5.3.2 相關熱圖分析
5.4 CPT酶表達對比分析
5.5 CPT2-knockdown肝癌細胞株脂酰肉堿代謝靶標分析
5.5.1 細胞系的篩選
5.5.2 siRNA的篩選
5.5.3 脂酰肉堿代謝靶標分析
5.6 組織脂肪酸代謝輪廓分析
5.7 本章小結
第6章 肝癌組織脂質組學研究
6.1 引言
6.2 脂質代謝輪廓分析
6.2.1 LC-MS譜圖比較
6.2.2 潛在差異性脂質離子的篩選
6.2.3 偏最小二乘判別分析
6.3 差異性脂質的篩選及鑒定
6.4 脂質代謝拓撲分析
6.5 脂質代謝通路分析
6.5.1 甘油磷脂代謝
6.5.2 甘油脂質代謝
6.5.3 鞘脂代謝
6.6 本章小結
結論
參考文獻
附錄
攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文及其它成果
致謝
個人簡歷
【相似文獻】
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本文編號：
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