肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,具有發(fā)病隱匿的特點(diǎn),被診斷時(shí)往往已經(jīng)到了中晚期,治療的預(yù)后效果較差。因此,肝癌的早期診斷及病情程度判定對(duì)于該病的防治及預(yù)后具有重要的臨床意義。而代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的新興方向,其主要是基于高靈敏、高通量的分析手段對(duì)生物體受擾動(dòng)后的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的整體變化輪廓進(jìn)行表征,具有靈敏、系統(tǒng)、動(dòng)態(tài)的研究特點(diǎn)。為此,本研究應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(liquid chromatography coupled to mass spectrometry,LC-MS)對(duì)肝癌血清及組織樣本采集代謝輪廓數(shù)據(jù),并利用單變量及多變量分析方法獲得穩(wěn)定可靠的血清診斷性代謝產(chǎn)物。在此基礎(chǔ)上,利用代謝通路及網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)合細(xì)胞及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探究。研究首先利用LC-MS技術(shù)分析獲得299例肝癌及320例對(duì)照組血清代謝輪廓的高通量數(shù)據(jù),利用主成分分析(principal components analysis,PCA)、偏最小二乘-判別分析(partial least square discriminant analysis,PLS-DA)模型分析了肝癌及對(duì)照組間的代謝輪廓。通過(guò)輪廓比對(duì)分析得出兩組代謝組學(xué)數(shù)據(jù)存在差異,PCA結(jié)果顯示檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性,PLS-DA分析結(jié)果顯示兩組具有顯著性差異,進(jìn)而利用隨機(jī)森林法獲得87個(gè)組間差異性代謝產(chǎn)物。在外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集中,利用Logistic回歸、Pearson相關(guān)性分析及受試者工作曲線(receiver operating characteristic,ROC)篩選得到D-半乳糖等可用于診斷的代謝標(biāo)志物。這些標(biāo)志物與甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)聯(lián)合診斷的靈敏度、特異度及單變量曲線下面積(area under the curve,AUC)分別為0.96、0.92、0.98,且將聯(lián)合指標(biāo)用于樣本集中AFP陰性樣本的預(yù)測(cè),可以達(dá)到準(zhǔn)確率78%,這一結(jié)果大大提高了AFP的診斷效能。而對(duì)于58例TNM I期樣本,以上物質(zhì)聯(lián)合診斷的單變量AUC也可以達(dá)到0.96,提示其對(duì)于早期肝癌也具有較好的判定效果。此外,結(jié)合型膽酸具有一定的分期相關(guān)的變化趨勢(shì),呈現(xiàn)出一定的早期診斷潛能。進(jìn)一步針對(duì)87個(gè)差異性代謝產(chǎn)物開(kāi)展了代謝通路分析及網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)脂酰肉堿呈現(xiàn)出側(cè)鏈長(zhǎng)度及不飽和度的聚簇及遞變規(guī)律,為相關(guān)機(jī)制研究提供參考。為了探討血清中差異性代謝產(chǎn)物與肝癌組織中差異性代謝物的關(guān)系,本研究還展開(kāi)了肝癌組織代謝輪廓分析。研究首先建立了基于LC-MS的肝癌代謝組學(xué)樣本處理及分析方法,并獲得80對(duì)肝癌及癌旁組織極性組分的代謝輪廓。PLS-DA模型表明肝癌及癌旁組織極性代謝輪廓具有顯著差異。進(jìn)一步利用正交隱變量投影-判別分析(orthogonal projection to latent structures discriminant analysis,OPLS-DA)模型獲得29個(gè)可以表征肝癌及癌旁組織間差異的極性差異性代謝產(chǎn)物。通過(guò)血清與組織極性代謝輪廓的對(duì)比,發(fā)現(xiàn)了4個(gè)血清-組織共有差異性代謝產(chǎn)物:C14脂酰肉堿、L-酪氨酸、溶血性卵磷脂Lyso PC(18:2)及L-谷氨酸鹽,并發(fā)現(xiàn)其在組織及血清中的變化趨勢(shì)均相同。此外,結(jié)合型膽酸被發(fā)現(xiàn)在組織中的變化趨勢(shì)與血清中相反且具有顯著性相關(guān),提示血清中結(jié)合型膽酸的變化可能源于肝癌組織。結(jié)合上述研究分析發(fā)現(xiàn),肝癌樣本的中短鏈脂酰肉堿降低及長(zhǎng)鏈脂酰肉堿升高的趨勢(shì)在血清及組織極性代謝輪廓存在一致性改變。為進(jìn)一步系統(tǒng)探究該趨勢(shì)的變化規(guī)律及相關(guān)機(jī)制,本研究利用代謝靶標(biāo)分析方法考察了80對(duì)肝癌及癌旁組織中不同類型的26個(gè)脂酰肉堿的變化趨勢(shì),并結(jié)合定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)、蛋白免疫印跡(Western blot)等分子生物學(xué)技術(shù)表征和驗(yàn)證了肝癌組織細(xì)胞中介導(dǎo)脂酰肉堿合成及分解的肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(carnitine palmitoyltransferase,CPT)的表達(dá)。結(jié)果顯示,CPT1A在肝癌及癌旁組織間的m RNA表達(dá)沒(méi)有區(qū)別,而CPT2在肝癌組織中的m RNA及蛋白的表達(dá)均顯著低于癌旁組織,提示CPT2酶的表達(dá)降低是導(dǎo)致不同長(zhǎng)度脂酰肉堿相對(duì)變化的誘因之一。為此,本研究構(gòu)建了BEL-7402/CPT2-knockdown細(xì)胞株,并利用代謝靶標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)相對(duì)于陰性對(duì)照細(xì)胞,CPT2-knockdown細(xì)胞株中的中短鏈脂酰肉堿降低且長(zhǎng)鏈脂酰肉堿升高,該趨勢(shì)與組織中的脂酰肉堿變化趨勢(shì)一致。以上結(jié)果表明CPT2的表達(dá)降低是導(dǎo)致不同長(zhǎng)度脂酰肉堿相對(duì)變化的誘因之一。除對(duì)肝癌組織極性組分代謝輪廓開(kāi)展分析之外,本研究進(jìn)一步優(yōu)化脂質(zhì)組學(xué)分析方法,系統(tǒng)地表征了肝癌組織脂質(zhì)代謝輪廓的變化及其規(guī)律。研究利用優(yōu)化后的LC-MS技術(shù)獲得高通量肝癌脂質(zhì)組數(shù)據(jù),應(yīng)用PLS-DA模型考察了肝癌及癌旁組織整體及不同類型脂質(zhì)代謝輪廓的差異,并最終鑒定了113個(gè)差異性脂質(zhì)分子。隨后,利用代謝拓?fù)浞治龊Y選變化顯著的脂質(zhì)代謝通路,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘油磷脂代謝、甘油脂質(zhì)代謝及鞘脂代謝三個(gè)通路呈現(xiàn)出顯著性改變,其變量(差異代謝物)在通路中具有重要調(diào)控意義(Impact大于0.1),覆蓋率p值小于0.05。此結(jié)果提示,這三個(gè)通路中的代謝酶在肝癌組織中呈現(xiàn)出顯著性變化。進(jìn)一步結(jié)果顯示,磷脂酰乙醇胺及磷脂酰絲氨酸在肝癌組織中分別呈現(xiàn)降低及升高的趨勢(shì),與甘油磷脂代謝通路中介導(dǎo)二者轉(zhuǎn)化的磷脂酰絲氨酸合成酶2(phosphatidylserine synthase 2,PTDSS2)在肝癌中的m RNA表達(dá)升高相符。同理,甘油三酯的降低與甘油二酯的升高也與脂蛋白酯酶(lipoprteinlipase,LPL)的表達(dá)及酶活性的升高相符,表明了上述代謝通路中確實(shí)存在代謝酶的改變,同時(shí)也提示LPL的表達(dá)升高是導(dǎo)致甘油二酯(diacylglycerol,DG)與甘油三酯(triacylglycerol,TG)轉(zhuǎn)化失衡的原因。而DG則是磷磷脂酰肌醇細(xì)胞信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子,被定義為第二信使,在腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要的意義。綜上所述,本文利用代謝組學(xué)的研究策略篩選了具有較好臨床診斷效能的潛在血清代謝標(biāo)志物;同時(shí)還基于組織代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái),結(jié)合細(xì)胞及分子生物學(xué)手段初步探討了肝癌組織脂酰肉堿相關(guān)變化的機(jī)制;并利用脂質(zhì)組學(xué)策略結(jié)合代謝通路及拓?fù)浞治鎏骄苛烁伟┙M織脂質(zhì)代謝輪廓及相關(guān)通路的變化規(guī)律。因此,本研究為肝癌的臨床診斷及相關(guān)病理機(jī)制研究提供價(jià)值信息。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7