本文選題：SRPK1 + siRNA�。� 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景及目的：白血病約占兒童惡性腫瘤的三分之一,在發(fā)達(dá)地區(qū)的大城市中,惡性腫瘤已是兒童首位的致死疾病,而白血病首當(dāng)其沖,深入研究?jī)和籽〉姆乐斡兄匾目茖W(xué)意義和社會(huì)意義。白血病的治療以化學(xué)藥物治療(化療)為主要。目前在臨床使用的多數(shù)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的選擇性低,在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)容易引起嚴(yán)重不良反應(yīng)如：骨髓抑制、嚴(yán)重感染等。因此,腫瘤的靶向治療方式受到日益關(guān)注。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在生物進(jìn)化過(guò)程中由高度保守的雙鏈RNA誘發(fā)的,使同源的mRNA發(fā)生高效特異性降解的現(xiàn)象。由于該技術(shù)可以使特定的基因表達(dá)發(fā)生特異性剔除或關(guān)閉,所以在遺傳性疾病、傳染性疾病和惡性腫瘤等的基因治療領(lǐng)域得到迅速發(fā)展。絲氨酸-精氨酸蛋白激酶(Serine-arginine protein kinases, SRPKs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族中一個(gè)重要的組成部分,其在絲氨酸特異性磷酸化的過(guò)程中起著重要作用。SRPKs在mRNA (Messenger RNA)的選擇性剪接,體細(xì)胞和精子的核染色質(zhì)重新分布,細(xì)胞周期和p53調(diào)控,細(xì)胞代謝信號(hào)等過(guò)程中均有至關(guān)重要的作用。其中研究最深入的是SRPK1。SRPK1作為一種SR(Serine-arginine)剪接因子磷酸化蛋白起著積聚功能信號(hào)和調(diào)控SRPKs家族其他成員的作用。目前研究認(rèn)為SRPKs有可能成為腫瘤治療的靶點(diǎn),其原因在于在某些腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SRPKs的高表達(dá),對(duì)腫瘤細(xì)胞的SRPK1基因干擾后發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞的增殖率降低,凋亡潛能增加,并且對(duì)化療藥物的敏感性提高。本實(shí)驗(yàn)擬利用RNA干擾技術(shù),以人類白血病K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞,觀察SRPK1基因沉默后對(duì)人K562細(xì)胞增殖和凋亡的影響。首先我們合成SRPKl-siRNA,將其轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞內(nèi),采用MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)等觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。此外我們采用western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡的通路蛋白caspase-3、PARP和Bcl-2/Bax在K562細(xì)胞凋亡過(guò)程中的表達(dá),為白血病的靶向治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法：1.抑制SRPK1表達(dá)對(duì)白血病K562細(xì)胞增殖能力的影響(1)K562細(xì)胞系的培養(yǎng)取傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞,用吸管吹勻,收集至離心管中,1000rpm離心5min,棄上清,輕輕震蕩懸起沉淀,加入5ml完全培養(yǎng)基,吹打均勻；將細(xì)胞懸液加入至培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)充RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640)完全培養(yǎng)基至10ml；將培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。(2)RNA干擾實(shí)驗(yàn)化學(xué)合成SRPKl-siRNA,按siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明,利用C10511-1 riboFectTM CP Transfection Kit(333T)轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。取相應(yīng)體積和質(zhì)量的特異性siRNA及其對(duì)照conRNA溶于100μl的RPMI1640培養(yǎng)基中,輕輕混勻；取一定體積的C10511-1 riboFectTM溶于100μl的RPMI1640培養(yǎng)基中,輕輕混勻；室溫5分鐘；把稀釋的RNA和稀釋的C10511-1 riboFectTM混勻,室溫孵育20分鐘；將200μl復(fù)合物加入到含有無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板中,輕輕晃動(dòng)使充分混勻；4-6小時(shí)后換新鮮完全培養(yǎng)基,利用流式細(xì)胞術(shù)在相應(yīng)的時(shí)間檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照細(xì)胞總RNA提取步驟提取細(xì)胞的總RNA。取RNA樣品,稀釋100倍后在分光光度計(jì)上測(cè)定260nm、280nm處的吸光值。計(jì)算RNA濃度,公式(μg/ml) =A260×40(μg/ml)×稀釋倍數(shù)。A260／A280處于1.9-2.0之間。根據(jù)RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒的說(shuō)明及操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR,檢測(cè)對(duì)照組及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的SPRK1的表達(dá)。(4)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的K562細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,依照上述siRNA轉(zhuǎn)染方法,分別轉(zhuǎn)入50nM和100nM的siRNA;于37℃、5%CO：恒溫箱中培養(yǎng)24h,48h,72h后,每孔加入10μl MTT (5mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4h；離心后棄上清,每孔加入100μl DMSO,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上,測(cè)定490nm處各孔光的吸收值(OD值),計(jì)算K562細(xì)胞增殖活性。(5)細(xì)胞周期檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染后對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的K562細(xì)胞,用70%乙醇重懸細(xì)胞固定30分鐘；離心收集細(xì)胞后,用RNA酶消化細(xì)胞,室溫放置30分鐘；再次離心洗滌細(xì)胞,用PI染料處理細(xì)胞20分鐘；在流式細(xì)胞儀488nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定。2.抑制SRPK1表達(dá)對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集轉(zhuǎn)染后對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的K562細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗一遍；離心收集細(xì)胞,用200μ1結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；每管加5μl Annexin-V/FITC和10μl 20μg/mL PI溶液；室溫避光孵育15分鐘后,轉(zhuǎn)入流式管,上機(jī)檢測(cè)。(2) Western檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白采用全蛋白提取裂解液提取細(xì)胞總蛋白后,在酶標(biāo)儀讀取OD595nm處光吸收值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算蛋白質(zhì)含量。按照western實(shí)驗(yàn)技術(shù)的操作步驟檢測(cè)凋亡通路蛋白caspase3、激活的caspase3、PARP、激活的PARP和Bcl-2/Bax的表達(dá)水平。3.統(tǒng)計(jì)方法采用數(shù)據(jù)分析軟件IBM SPSS Statistics 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。雙側(cè)p0.05認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示符合正態(tài)分布的連續(xù)變量。對(duì)連續(xù)變量采用t檢驗(yàn)及方差分析。研究結(jié)果：1.抑制SRPK1表達(dá)對(duì)白血病K562細(xì)胞增能力的影響(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞的抑制率為檢測(cè)siRNA能否轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞內(nèi),我們?cè)O(shè)計(jì)合成一個(gè)帶GFP熒光標(biāo)記的,與SRPK1無(wú)關(guān)序列的siRNA轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞內(nèi),用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示siRNA濃度為50nM時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率為78.14±2.59%,且平均熒光強(qiáng)度(MFI)為96.43±3.62。siRNA濃度為100nM時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率為93.37±3.36%,MFI為125.15±2.73。將兩個(gè)濃度的siRNA疊加后可以看出,100nM的siRNA轉(zhuǎn)染后峰值后移,熒光強(qiáng)度大,對(duì)細(xì)胞的抑制效果優(yōu)于50nM的siRNA。(2) Real-time PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SRPK1的表達(dá)通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)基因表達(dá)可以看出試劑組表達(dá)量高,說(shuō)明轉(zhuǎn)染試劑細(xì)胞毒性小,無(wú)關(guān)序列的對(duì)照siRNA對(duì)SRPK1的表達(dá)無(wú)明顯影響。合成的三條SRPK1-siRNA序列s1,s2,s3均可以抑制SRPK1的表達(dá)。s2與s3的效果優(yōu)于s1,且濃度為100nnM時(shí)優(yōu)于50nM。(3)MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖試劑組和無(wú)關(guān)序列對(duì)照組對(duì)細(xì)胞的抑制率最低。試劑組在細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)對(duì)細(xì)胞的最大抑制率為9.65±1.98%,對(duì)照組100nM培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)抑制率最高為11.49±1.02%。合成的三條SRPK1-siRNA對(duì)細(xì)胞的抑制均有明顯增加。其中s2序列的效果最好,其次為s3序列。s2和s3序列對(duì)細(xì)胞的抑制率在100nM濃度時(shí)優(yōu)于50nM。s3序列在100nM培養(yǎng)48小時(shí)抑制率為44.88±3.87%,同樣時(shí)間和濃度的s2序列的抑制率為49.62±4.33%,為最高。培養(yǎng)72小時(shí)后抑制率較前均有下降。s3序列100nM培養(yǎng)72小時(shí)抑制率為38.68±2.57%,s2序列在相同時(shí)間和濃度也較前下降為42.14±2.94%。綜上所述,s2及s3序列的抑制細(xì)胞增殖效果優(yōu)于s1,且100nM時(shí)優(yōu)于50nM濃度的siRNA。(4)細(xì)胞周期檢測(cè)通過(guò)之前Real-time PCR實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選擇合成SRPKl-siRNA的s2和s3序列且濃度為1OOnM做為實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組。通過(guò)細(xì)胞周期變化可以看出,對(duì)照1組和2組,處于S期的細(xì)胞分別為53.93±3.15%和54.74±4.26%均高于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組處于S期的細(xì)胞43.82±2.61%和44.32±3.52%。且實(shí)驗(yàn)1組和2組處于S期的細(xì)胞無(wú)明顯差別。四組細(xì)胞周期圖中CV值偏少,說(shuō)明變異率小,結(jié)果準(zhǔn)確。2.抑制SRPK1表達(dá)對(duì)白血病K562細(xì)胞凋亡的影響(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡通過(guò)第一部分研究Real-time PCR實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選擇合成SRPK1-siRNA的s2和s3序列且濃度為100nM做為實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組。通過(guò)細(xì)胞凋亡的散點(diǎn)圖可以看出對(duì)照1組和對(duì)照2組,凋亡細(xì)胞百分比偏少,分別為2.09±1.98%和3.14±2.16%。且處于早期凋亡的細(xì)胞也偏少,分別為5.01±2.36%和5.47±1.83%。實(shí)驗(yàn)組凋亡的細(xì)胞明顯增加。s2干擾序列凋亡的細(xì)胞29.95±3.27%,早期凋亡細(xì)胞為15.13±4.02%,s3干擾序列凋亡的細(xì)胞31.4±2.85%,早期凋亡細(xì)胞為15.93±3.52%。s3序列對(duì)細(xì)胞凋亡的效果好于s2序列。(2) Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組分組同上。Caspase3蛋白的表達(dá)在四組之間無(wú)明顯差異,但Cleaved caspase3實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有明顯差異。其中s3的灰度值最高,說(shuō)明表達(dá)量最多。PARP與內(nèi)參指數(shù)P-actin比較無(wú)明顯差異,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組略有下降,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而Cleaved PARP的表達(dá),實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯增加。實(shí)驗(yàn)2組的灰度值最高,表達(dá)增加。抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax組合,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯下降,且兩實(shí)驗(yàn)組之間比較無(wú)明顯差異。研究結(jié)論：1.采用siRNA技術(shù)對(duì)SRPK1基因進(jìn)行干擾,使其沉默,可以減少K562細(xì)胞的增殖。我們合成的小干擾RNA序列s2和s3效果明顯,可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),檢測(cè)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。2.通過(guò)siRNA干擾SRPK1表達(dá)后,啟動(dòng)了細(xì)胞的凋亡。凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡的效應(yīng)蛋白caspase3、PARP被啟動(dòng),抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax明顯降低,促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[Abstract]:In this study , SRPKs has been used as a target for tumor therapy . adding 5 ml of complete culture medium , and blowing evenly ;
The cell suspension was added to the culture flask and supplemented with RPMI 1640 ( Roswell Park Memorial Institute 1640 ) in complete medium to 10 ml ;
The culture flask was cultured in incubator at 37 鈩，

本文編號(hào)：1926973