本文選題：SRPK1 + siRNA�。� 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景及目的：白血病約占兒童惡性腫瘤的三分之一,在發(fā)達地區(qū)的大城市中,惡性腫瘤已是兒童首位的致死疾病,而白血病首當其沖,深入研究兒童白血病的防治有重要的科學意義和社會意義。白血病的治療以化學藥物治療(化療)為主要。目前在臨床使用的多數化療藥物對腫瘤細胞和正常細胞的選擇性低,在殺傷腫瘤細胞的同時容易引起嚴重不良反應如：骨髓抑制、嚴重感染等。因此,腫瘤的靶向治療方式受到日益關注。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在生物進化過程中由高度保守的雙鏈RNA誘發(fā)的,使同源的mRNA發(fā)生高效特異性降解的現象。由于該技術可以使特定的基因表達發(fā)生特異性剔除或關閉,所以在遺傳性疾病、傳染性疾病和惡性腫瘤等的基因治療領域得到迅速發(fā)展。絲氨酸-精氨酸蛋白激酶(Serine-arginine protein kinases, SRPKs)是近年來發(fā)現的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族中一個重要的組成部分,其在絲氨酸特異性磷酸化的過程中起著重要作用。SRPKs在mRNA (Messenger RNA)的選擇性剪接,體細胞和精子的核染色質重新分布,細胞周期和p53調控,細胞代謝信號等過程中均有至關重要的作用。其中研究最深入的是SRPK1。SRPK1作為一種SR(Serine-arginine)剪接因子磷酸化蛋白起著積聚功能信號和調控SRPKs家族其他成員的作用。目前研究認為SRPKs有可能成為腫瘤治療的靶點,其原因在于在某些腫瘤細胞中發(fā)現SRPKs的高表達,對腫瘤細胞的SRPK1基因干擾后發(fā)現,腫瘤細胞的增殖率降低,凋亡潛能增加,并且對化療藥物的敏感性提高。本實驗擬利用RNA干擾技術,以人類白血病K562細胞作為靶細胞,觀察SRPK1基因沉默后對人K562細胞增殖和凋亡的影響。首先我們合成SRPKl-siRNA,將其轉染至K562細胞內,采用MTT實驗、細胞周期實驗、細胞凋亡實驗等觀察其對腫瘤細胞的影響。此外我們采用western blot實驗進一步研究細胞凋亡的通路蛋白caspase-3、PARP和Bcl-2/Bax在K562細胞凋亡過程中的表達,為白血病的靶向治療提供新的實驗依據。研究方法：1.抑制SRPK1表達對白血病K562細胞增殖能力的影響(1)K562細胞系的培養(yǎng)取傳代培養(yǎng)后的細胞,用吸管吹勻,收集至離心管中,1000rpm離心5min,棄上清,輕輕震蕩懸起沉淀,加入5ml完全培養(yǎng)基,吹打均勻；將細胞懸液加入至培養(yǎng)瓶中,補充RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640)完全培養(yǎng)基至10ml；將培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。(2)RNA干擾實驗化學合成SRPKl-siRNA,按siRNA轉染試劑盒說明,利用C10511-1 riboFectTM CP Transfection Kit(333T)轉染試劑進行細胞轉染。取相應體積和質量的特異性siRNA及其對照conRNA溶于100μl的RPMI1640培養(yǎng)基中,輕輕混勻；取一定體積的C10511-1 riboFectTM溶于100μl的RPMI1640培養(yǎng)基中,輕輕混勻；室溫5分鐘；把稀釋的RNA和稀釋的C10511-1 riboFectTM混勻,室溫孵育20分鐘；將200μl復合物加入到含有無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板中,輕輕晃動使充分混勻；4-6小時后換新鮮完全培養(yǎng)基,利用流式細胞術在相應的時間檢測轉染效率。(3)實時熒光定量PCR按照細胞總RNA提取步驟提取細胞的總RNA。取RNA樣品,稀釋100倍后在分光光度計上測定260nm、280nm處的吸光值。計算RNA濃度,公式(μg/ml) =A260×40(μg/ml)×稀釋倍數。A260／A280處于1.9-2.0之間。根據RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒的說明及操作步驟進行逆轉錄和實時熒光定量PCR,檢測對照組及轉染后細胞的SPRK1的表達。(4)MTT法檢測細胞增殖收集對數期生長的K562細胞,調整細胞濃度,依照上述siRNA轉染方法,分別轉入50nM和100nM的siRNA;于37℃、5%CO：恒溫箱中培養(yǎng)24h,48h,72h后,每孔加入10μl MTT (5mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4h；離心后棄上清,每孔加入100μl DMSO,在酶聯免疫檢測儀上,測定490nm處各孔光的吸收值(OD值),計算K562細胞增殖活性。(5)細胞周期檢測收集轉染后對數期生長的K562細胞,用70%乙醇重懸細胞固定30分鐘；離心收集細胞后,用RNA酶消化細胞,室溫放置30分鐘；再次離心洗滌細胞,用PI染料處理細胞20分鐘；在流式細胞儀488nm激發(fā)波長下測定。2.抑制SRPK1表達對白血病K562細胞凋亡的影響(1)流式細胞術檢測細胞凋亡收集轉染后對數期生長的K562細胞,用預冷的PBS洗一遍；離心收集細胞,用200μ1結合緩沖液重懸細胞；每管加5μl Annexin-V/FITC和10μl 20μg/mL PI溶液；室溫避光孵育15分鐘后,轉入流式管,上機檢測。(2) Western檢測凋亡相關蛋白采用全蛋白提取裂解液提取細胞總蛋白后,在酶標儀讀取OD595nm處光吸收值,繪制標準曲線,計算蛋白質含量。按照western實驗技術的操作步驟檢測凋亡通路蛋白caspase3、激活的caspase3、PARP、激活的PARP和Bcl-2/Bax的表達水平。3.統(tǒng)計方法采用數據分析軟件IBM SPSS Statistics 20.0進行數據統(tǒng)計分析。雙側p0.05認為有顯著的統(tǒng)計學差異。采用“均數±標準差”的形式表示符合正態(tài)分布的連續(xù)變量。對連續(xù)變量采用t檢驗及方差分析。研究結果：1.抑制SRPK1表達對白血病K562細胞增能力的影響(1)流式細胞術檢測siRNA轉染后對細胞的抑制率為檢測siRNA能否轉染到K562細胞內,我們設計合成一個帶GFP熒光標記的,與SRPK1無關序列的siRNA轉染到K562細胞內,用流式細胞術檢測轉染效果。結果顯示siRNA濃度為50nM時對細胞的抑制率為78.14±2.59%,且平均熒光強度(MFI)為96.43±3.62。siRNA濃度為100nM時對細胞的抑制率為93.37±3.36%,MFI為125.15±2.73。將兩個濃度的siRNA疊加后可以看出,100nM的siRNA轉染后峰值后移,熒光強度大,對細胞的抑制效果優(yōu)于50nM的siRNA。(2) Real-time PCR方法檢測轉染后SRPK1的表達通過熒光定量PCR方法檢測基因表達可以看出試劑組表達量高,說明轉染試劑細胞毒性小,無關序列的對照siRNA對SRPK1的表達無明顯影響。合成的三條SRPK1-siRNA序列s1,s2,s3均可以抑制SRPK1的表達。s2與s3的效果優(yōu)于s1,且濃度為100nnM時優(yōu)于50nM。(3)MTT方法檢測細胞增殖試劑組和無關序列對照組對細胞的抑制率最低。試劑組在細胞培養(yǎng)48小時時對細胞的最大抑制率為9.65±1.98%,對照組100nM培養(yǎng)48小時時抑制率最高為11.49±1.02%。合成的三條SRPK1-siRNA對細胞的抑制均有明顯增加。其中s2序列的效果最好,其次為s3序列。s2和s3序列對細胞的抑制率在100nM濃度時優(yōu)于50nM。s3序列在100nM培養(yǎng)48小時抑制率為44.88±3.87%,同樣時間和濃度的s2序列的抑制率為49.62±4.33%,為最高。培養(yǎng)72小時后抑制率較前均有下降。s3序列100nM培養(yǎng)72小時抑制率為38.68±2.57%,s2序列在相同時間和濃度也較前下降為42.14±2.94%。綜上所述,s2及s3序列的抑制細胞增殖效果優(yōu)于s1,且100nM時優(yōu)于50nM濃度的siRNA。(4)細胞周期檢測通過之前Real-time PCR實驗和MTT實驗結果,我們選擇合成SRPKl-siRNA的s2和s3序列且濃度為1OOnM做為實驗1組和實驗2組。通過細胞周期變化可以看出,對照1組和2組,處于S期的細胞分別為53.93±3.15%和54.74±4.26%均高于兩個實驗組處于S期的細胞43.82±2.61%和44.32±3.52%。且實驗1組和2組處于S期的細胞無明顯差別。四組細胞周期圖中CV值偏少,說明變異率小,結果準確。2.抑制SRPK1表達對白血病K562細胞凋亡的影響(1)流式細胞術檢測細胞凋亡通過第一部分研究Real-time PCR實驗和MTT實驗結果,我們選擇合成SRPK1-siRNA的s2和s3序列且濃度為100nM做為實驗1組和實驗2組。通過細胞凋亡的散點圖可以看出對照1組和對照2組,凋亡細胞百分比偏少,分別為2.09±1.98%和3.14±2.16%。且處于早期凋亡的細胞也偏少,分別為5.01±2.36%和5.47±1.83%。實驗組凋亡的細胞明顯增加。s2干擾序列凋亡的細胞29.95±3.27%,早期凋亡細胞為15.13±4.02%,s3干擾序列凋亡的細胞31.4±2.85%,早期凋亡細胞為15.93±3.52%。s3序列對細胞凋亡的效果好于s2序列。(2) Western Blotting檢測凋亡相關蛋白對照和實驗組分組同上。Caspase3蛋白的表達在四組之間無明顯差異,但Cleaved caspase3實驗組和對照組有明顯差異。其中s3的灰度值最高,說明表達量最多。PARP與內參指數P-actin比較無明顯差異,實驗組較對照組略有下降,無統(tǒng)計學意義。然而Cleaved PARP的表達,實驗組較對照組明顯增加。實驗2組的灰度值最高,表達增加�？沟蛲龅鞍譈cl-2/Bax組合,實驗組較對照組明顯下降,且兩實驗組之間比較無明顯差異。研究結論：1.采用siRNA技術對SRPK1基因進行干擾,使其沉默,可以減少K562細胞的增殖。我們合成的小干擾RNA序列s2和s3效果明顯,可以進行下一步實驗,檢測細胞凋亡及凋亡相關蛋白的表達。2.通過siRNA干擾SRPK1表達后,啟動了細胞的凋亡。凋亡相關蛋白檢測發(fā)現,細胞凋亡的效應蛋白caspase3、PARP被啟動,抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax明顯降低,促使細胞發(fā)生凋亡。
[Abstract]:In this study , SRPKs has been used as a target for tumor therapy . adding 5 ml of complete culture medium , and blowing evenly ;
The cell suspension was added to the culture flask and supplemented with RPMI 1640 ( Roswell Park Memorial Institute 1640 ) in complete medium to 10 ml ;
The culture flask was cultured in incubator at 37 鈩，

本文編號：1926973