本文選題：食管癌 + miR-183��； 參考：《東南大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景與目的食管癌是常見的消化道惡性腫瘤,我國是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家之一。在中國食管癌的病理類型以鱗狀細胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC)為主。闡釋食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,開發(fā)和改進食管癌的篩查和早期診斷技術,是降低食管癌發(fā)病率和死亡率的關鍵。本研究在miRNA芯片高通量篩選結合生物信息學分析的基礎上遴選食管癌發(fā)生發(fā)展相關的候選miRNA,進一步擴大樣本量,利用熒光定量RT-PCR技術驗證并建立食管癌miRNA差異表達譜。在差異表達的miRNAs中選取反復驗證的miR-183和miR-218進行后續(xù)的功能研究,探索miR-183和miR-218在食管癌細胞中的生物學作用,通過識別和驗證其下游靶基因,初步探討miR-183和miR-218影響食管癌細胞生長、增殖、凋亡等生物學行為的分子機制。同時針對miR-218在食管癌中的異常表達,進行初步的機制研究,為闡明食管癌的發(fā)病機理、發(fā)現候選生物標志提供線索。研究方法1.在針對食管癌相關環(huán)境危險因素的流行病學問卷調查的基礎上,招募138例未接受放化療的原發(fā)食管鱗狀細胞癌患者,收集其癌組織及癌旁組織。送檢3對食管鱗狀細胞癌患者癌組織和配對癌旁組織,應用Agilent miRNA表達譜芯片技術篩選差異表達的miRNA.采用熒光定量RT-PCR技術在擴大樣本人群中對篩選出的差異表達miRNA進行驗證,構建食管癌miRNA差異表達譜。根據候選miRNA的表達水平,連鎖分析miRNA的異常表達與食管癌發(fā)病風險之間的關系。根據環(huán)境危險因素調查結果,探討候選miRNA表達水平與食管癌患者吸煙、飲酒、飲水之間的相關性。2.利用1niR-183 mimic 和 inhibitor分別轉染食管癌細胞EC9706構建miR-183過表達及表達缺失的細胞模型,采用熒光定量RT-PCR方法檢測轉染后細胞miR-183的表達情況,確定轉染效率。在此基礎上分析miR-183對食管癌細胞生物學功能的影響,包括EdU法檢測細胞生長增殖、Annexin-V FITCPI雙染法檢測細胞凋亡、流式細胞術檢測細胞周期分布、以及Transwell法檢測細胞侵襲能力。利用靶基因預測軟件和nRNA表達譜芯片共同預測miR-183靶基因,通過累積分布函數方法分析生物信息學預測得到的靶基因與非靶基因在芯片中表達水平的差異。熒光定量RT-PCR和Western blot方法驗證miR-183在mRNA水平和蛋白水平對候選靶基因PDCD4的調控作用,并分析miR-183和PDCD4 mRNA在人群樣本中表達水平的關聯(lián)性。構建野生型和突變型PDCD43'UTR重組載體,采用雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-183與PDCD4的靶向調控關系。進一步分別構建包含3’UTR和3’UTR缺失的表達載體pcDNA3.1-PDCD4,通過基因回復實驗(DCD4 restore)分析miR-183通過影響PDCD4的生物學活性對食管癌細胞凋亡產生的調控作用,在功能層面驗證miR-183和PDCD4的靶向調控關系。3.利用甲基化在線預測軟件分析miR-218編碼基因啟動子區(qū)潛在的CpG位點。根據預測目的區(qū)域的DNA序列,分別采用亞硫酸鹽測序(BSP)和巢式甲基化特異性PCR(n-MSP)檢測兩株食管癌細胞EC9706和EC109中miR-218啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)。利用去甲基化劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)分別處理食管癌細胞株EC9706和EC109,分析去甲基化處理后miR-218表達水平的恢復情況；進一步在癌組織和癌旁組織中用n-MS P分析miR-218表達水平與其甲基化狀態(tài)之間的關系。熒光定量RT-PCR檢測miR-218與宿主基因SLIT2、SLIT3表達水平的相關性,分析miR-218與宿主基因的共調控關系。利用miR-218 mimic轉染食管癌細胞EC109構建miR-218過表達細胞模型,熒光定量PCR檢測轉染效率確定過表達模型構建成功的基礎上,進一步分析miR-218對食管癌細胞生物學功能的影響。同時利用生物信息學方法預測miR-218靶基因,熒光定量RT-PCR和Western blot檢測miR-218對靶基因ROBO1在mRNA水平和蛋白水平的調控,構建野生型和突變型ROBO1 3'UTR重組載體采用雙熒光素酶報告基因實驗進行靶基因鑒定。進一步分別構建包含3'UTR和3’UTR缺失的表達載體pcDNA3.1-ROBO1,通過基因回復實驗(ROBO1 restore)分析miR-218通過影響ROBO1的生物學活性從而對細胞增殖能力的調控作用,在功能層面驗證miR-218和ROBO1的靶向調控關系。4.招募食管癌患者和1：1匹配的健康對照血漿樣本79對。應用實時熒光RT-PCR方法分別檢測組織中差異表達的miR-183和miR-218在血漿中的表達水平。同時利用單因素logistic回歸分析miR-183和miR-218在血漿中的表達水平與食管癌發(fā)病風險間的關系,通過ROC曲線分析評估血漿niR-183 和 miR-218在食管癌中的診斷價值。主要研究結果1.食管癌組織nicroRNA差異表達譜的篩選利用Agilent miRNA表達譜芯片篩選出15個食管癌組織中差異表達的miRNA,其中食管癌組織中表達上調的miRNA7個,下調的miRNA8個。利用熒光定量RT-PCR在擴大的人群組織樣本中驗證后,確認7個食管癌相關差異表達miRNA與芯片結果一致(miR-139-5p, miR-218, miR-338-3p, miR-21-3p, miR-574-5p, miR-183, miR-601),證實了芯片數據的可靠性。其中,miR-183在食管癌組織中高表達,miR-218在食管癌組織中低表達。通過單因素logistic回歸分析發(fā)現其中niR-139-5p和miR-338-3 p的低表達,以及miR-21-3p、miR-574-5p、miR-183 和 miR-601的高表達與食管癌發(fā)病風險的增加顯著相關,進一步利用多因素logistic回歸分析發(fā)現miR-139-5p、miR-338-3p、 miR-574-5p和miR-601的異常表達增加了食管癌的發(fā)病風險,其中結合環(huán)境危險因素分析發(fā)現miR-21-3p的表達水平與飲酒量相關。2.miR-183調控食管癌發(fā)生發(fā)展的機制研究2.1 miR-183在食管癌細胞EC9706中功能研究分別應用]niR-183 mimic 和 inhibitor轉染食管癌細胞EC9706 48h后,與對照組相比,mimic轉染組miR-183的表達水平顯著升高(p0.001),inhibitor轉染組miR-183的表達水平顯著降低(p0.001),明確轉染成功后進行后續(xù)的細胞生物學功能實驗。細胞凋亡結果顯示,miR-183 mimic轉染組早期凋亡率明顯低于對照組(3.31±1.20 vs.7.43+1.01,p0.001),晚期凋亡率亦顯著低于對照組(5.83±0.29 vs.8.77±1.59,p0.01)。而miR-183 inhibitor轉染組早期凋亡率高于對照組(12.39±1.89 vs.6.56±1.87,p0.001),晚期凋亡率也高于對照組(9.53士1.58 vs.7.36±2.42,p0.05)。EdU法檢測細胞增殖能力結果顯示miR-183 mimic轉染組中處于增殖期的細胞比例顯著高于對照組p0.05)。細胞周期結果顯示轉染miR-183 mimic細胞與對照組相比G1期比例顯著下降(54.87±1.135vs.56.89±0.82,p0.05)。2.2 miR-183在食管癌細胞EC9706中靶基因的識別與驗證應用mRNA表達譜芯片在miR-183過表達EC9706細胞和對照組細胞中篩選候選靶基因。mRNA表達譜芯片共篩選出表達上調基因100個,下調基因83個,其中下調倍數前五位基因是：HLA-DRB5、ITGB1、MICB、PSEN2、PDCD4。對下調基因進行GO聚類和KEGG pathway分析。結果發(fā)現差異基因主要富集在細胞周期蛋白依賴性激酶調控信號通路上,并與多個腫瘤相關信號通路相關。基于芯片篩選結果,分別針對miRNA靶基因預測數據庫TargetScan預測出的靶基因與非靶基因在芯片中的表達水平進行累積分布函數分析,結果發(fā)現TargetScan預測到的靶基因表達水平明顯低于非靶基因(p0.001)。結合miRNA靶基因預測數據庫TargetScan和 miRDB,進一步分析并確認PDCD4為候選靶基因。熒光定量RT-PCR和Western blot結果發(fā)現miR-183主要抑制了PDCD4的蛋白質翻譯過程。雙熒光素酶報告基因結果顯示,共轉染miR-183 mimic和野生型PDCD4 3'UTR時,細胞熒光素酶活性被顯著抑制,約為NC和突變型載體共轉染組的47%(p0.01),從而證實miR-183與PDCD4 3'UTR有直接靶向結合關系。通過相關性分析發(fā)現miR-183與PDCD4 mRNA的表達水平在食管癌組織中呈負相關關系(r=-0,189,p0.05)。PDCD4 restore結果發(fā)現,分別轉染包含3'UTR或3’UTR缺失的PDCD4表達載體時,細胞的凋亡率無顯著性差異,而共轉染包含3'UTR PDCD4載體和miR-183mimic時,細胞凋亡明顯低于其他各組(p0.01)。3. miR-218調控食管癌發(fā)生發(fā)展的機制研究3.1 miR-218 CpG島甲基化狀態(tài)檢測應用CpG island searcher (http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx)分析miR-218編碼基因(miR-218-K miR-218-2)啟動子區(qū)CpG島覆蓋情況,結果發(fā)現編碼基因miR-218-1轉錄起始位點TSS上游-760到一212處,編碼基因]miR-218-2TSS的-407到+117處均為CpG島富集區(qū)域。針對此區(qū)域DNA序列設計引物,采用BSP和n-MSP檢測食管癌細胞株EC109和EC9706 CpG島甲基化水平,發(fā)現miR-218-1和niR-218-2區(qū)域均呈現高甲基化水平。采用5-Aza-CdR去甲基化處理兩株食管癌細胞EC109、EC9706和一株人正常食管上皮Het-1A,結果發(fā)現處理后細胞miR-218的表達水平升高,而Het-1A中miR-218表達無明顯改變。利用n-MSP檢測食管組織中miR-218-1和miR-218-2的甲基化水平,發(fā)現miR-218-1在癌組織中甲基化率(34/42)顯著高于癌旁組織(14/42)p0.05),但miR-218-2甲基化率在癌組織和癌旁組織中無顯著差異。分別將組織樣本按照miR-218-1 和 miR-218-2的甲基化水平將其分為甲基化組和非甲基化組,與miR-218的表達水平進行關聯(lián)分析,結果顯示miR-218-1甲基化組中miR-218的表達水平顯著低于非甲基化組；而對于miR-218-2而言,其甲基化與否和miR-218的表達水平無顯著相關性。熒光定量RT-PCR檢測組織樣本中miR-218、SLIT2、SLIT3的表達水平,結果顯示,SLIT2在癌組織中表達水平為癌旁組織的38.5%(p0.01),但SLIT3在癌組織和癌旁組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義,而宿主基因SLIT2和SLIT3與miR-218的表達均顯著相關(p0.001),提示miR-218與宿主基因可能共轉錄。3.2 miR-218在食管癌細胞EC109中功能研究miR-218 mimic轉染食管癌細胞EC109 48h后,與對照組相比,miR-218的相對表達水平顯著升高(p0.001)。EdU結果顯示miR-218 mimic轉染組中細胞增殖能力(53.45±1.20)%明顯低于陰性對照組(73.61+3.21)%(p0.001)。細胞周期結果顯示miR-218mimic轉染組的Gl期細胞比例增加(p0.01),G2期減少(p0.01),S期無明顯變化。但]miR-218 mimic對細胞凋亡的改變并不明顯。3.3 miR-218在食管癌細胞EC109中靶基因的識別與驗證挑選靶基因預測數據庫TargetScan、miRDB 和 Pictar 3個數據庫均預測到的ROBO1為候選靶基因。熒光定量PCR和Western blot發(fā)現在mRNA和蛋白水平miR-218均能調控ROBO1的表達。雙熒光素酶報告基因結果顯示miR-218與野生型ROBO1 3'UTR共轉染組熒光素酶活性與其他各組相比顯著降低,是陰性對照與突變型ROBO1 3'UTR共轉染組的55.7% (p0.001)。相關性分析揭示了人群樣本中miR-218與ROBO1 mRNA的表達負性相關(r=-0.258,p 0.05)。ROBO1 restore結果表明,與對照組相比,包含3'UTR的ROBO1表達載體和1miR-218 mimic共轉染時,細胞的增殖能力明顯低于其他各組(p0.01)。4.miR-183和miR-218在食管癌篩檢中的診斷價值研究熒光定量RT-PCR結果顯示,與健康對照比較,食管癌患者血漿中miR-183的表達水平明顯增加(p0.05),而miR-218的表達顯著降低(p 0.001). Logistic回歸分析發(fā)現血漿中miR-218的低表達與食管癌發(fā)病風險的增加有關(OR=0.787,0=0.685-0.903)p0.001)。ROC曲線評估血漿miR-218診斷食管癌的AUC為0.651(p=0.001)。初步研究結論1.本研究在食管癌組織和癌旁組織中共篩選分析得到7個差異表達的miRNA,其中3個miRNA表達上調,4個miRNA表達下調。miR-183在食管癌組織中顯著高表達,miR-218在食管癌組織中顯著低表達。2.增加食管癌細胞EC9706中miR-183的表達水平可誘導EC9706的增殖能力,抑制細胞凋亡,縮短G1期比例。miR-183通過作用于其靶基因PDCD4的3’UTR區(qū)域參與調控食管癌細胞的凋亡過程。3.miR-218在食管癌中的低表達與miR-218的編碼基因miR-218-1啟動子區(qū)CpG島異常高甲基化有關。增加食管癌細胞EC109中miR-218的表達可有效抑制EC109的細胞增殖能力,阻滯細胞周期于G1期。miR-218通過作用于其靶基因ROBO1 3'UTR區(qū)域參與調控食管癌細胞的增殖。4.血漿中miR-218和miR-183的表達水平與組織中的趨勢一致,其中miR-218在食管癌患者血漿中表達顯著低于健康對照者,而miR-183在食管癌患者中表達顯著高于健康者對照。根據血漿miR-218的表達水平,可以有效的區(qū)分食管癌患者和健康對照者,是食管癌潛在的診斷生物標志,可對現有食管癌早期診斷方法進行有效補充。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1

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本文編號：1923592