本文選題：肝癌 + 轉(zhuǎn)移��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:在世界范圍內(nèi),原發(fā)性肝癌(Hepatocellular caicinoma,HCC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,而且其中半數(shù)以上的原發(fā)性肝癌新發(fā)和死亡病例在我國(guó)發(fā)生。目前,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),在原發(fā)性肝癌中表達(dá)水平失調(diào)的microRNA與增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成、凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多個(gè)原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程相關(guān)。因此,本研究的目的主要為在眾多的microRNA中,找出原發(fā)性肝癌中表達(dá)水平失調(diào)的microRNA,并研究表達(dá)水平失調(diào)的microRNA在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)增殖、粘附、遷移、侵襲、凋亡、血管生成等重要生物學(xué)功能的影響,并對(duì)microRNA發(fā)揮作用的直接靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和驗(yàn)證,來(lái)探究micro RNA在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用的具體機(jī)制。方法:1、使用多種分析方法對(duì)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中公開(kāi)發(fā)布的microRNA高通量芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,初步篩選在原發(fā)性肝癌組織中表達(dá)水平失調(diào)的microRNA,并通過(guò)查閱分析文獻(xiàn)和具體分析microRNA芯片數(shù)據(jù)確定進(jìn)一步研究的目標(biāo)microRNA。2、用收集的原發(fā)性肝癌組織樣本和癌旁組織樣本,六種肝癌細(xì)胞系BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1、HuH-7、Hep G2、Li7以及人正常胎肝細(xì)胞系L02進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證mi R-214-3p是否的確在原發(fā)性肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)水平降低。3、對(duì)原發(fā)性肝癌組織的miR-214-3p表達(dá)水平和臨床病理信息進(jìn)行相關(guān)性分析。4、將miR-214-3p mimics轉(zhuǎn)染入BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1三種肝癌細(xì)胞系,上調(diào)miR-214-3p的表達(dá)水平,并進(jìn)行MTS增殖實(shí)驗(yàn)、transwell遷移實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn),來(lái)研究mi R-214-3p在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)增殖、遷移、侵襲等重要生物學(xué)功能的影響。5、建立人肝癌裸鼠經(jīng)血途徑肺轉(zhuǎn)移模型,將預(yù)先用miR-214-3p agomir孵育的SK-HEP-1細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射接種入裸鼠體內(nèi),動(dòng)物整體活體成像觀察后再取裸鼠肺進(jìn)行成像觀察和HE病理染色,計(jì)數(shù)分析轉(zhuǎn)移灶。6、通過(guò)使用TargetScan等軟件預(yù)測(cè)miR-214-3p發(fā)揮作用的直接靶基因。7、通過(guò)臨床標(biāo)本的miR-214-3p熒光原位雜交和HMGA1免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析HMGA1和miR-214-3p的共表達(dá)情況,并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)來(lái)確定miR-214-3p是否特異性結(jié)合HMGA1基因的3’-UTR區(qū)。8、進(jìn)行miR-214-3p的拯救實(shí)驗(yàn),即構(gòu)建缺失3’-UTR的HMGA1過(guò)表達(dá)載體,與mi R-214-3p mimics共轉(zhuǎn)染入BEL-7402、SMMC-7721、SK-HEP-1三種肝癌細(xì)胞系,進(jìn)行MTS增殖、transwell遷移和transwell侵襲實(shí)驗(yàn),來(lái)探究miR-214-3p多大程度上是通過(guò)HMGA1來(lái)影響下游的生物學(xué)功能。結(jié)果:1、分析GSE36915芯片數(shù)據(jù)后我們發(fā)現(xiàn):和非腫瘤肝臟組織相比,有49個(gè)較高豐度microRNA在原發(fā)性肝癌組織中的表達(dá)水平明顯降低,其中,miR-199a-2/214簇中的三個(gè)microRNA成熟體miR-214-3p、199a-5p、199a-3p均明顯下調(diào),其中miR-214-3p降低幅度最大;與非腫瘤肝臟組織相比,85%(58/68)原發(fā)性肝癌組織中miR-214-3p的表達(dá)水平都明顯下調(diào)。2、芯片分析結(jié)果的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證實(shí)了肝癌組織樣本中miR-214-3p的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織樣本,此外六種人肝癌細(xì)胞系中miR-214-3p的表達(dá)水平也均明顯低于人正常胎肝細(xì)胞系L02。3、miR-214-3p的表達(dá)水平降低與原發(fā)性肝癌TNM分期(P=0.0002)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(P=0.0046)密切相關(guān),但與年齡、性別、甲胎蛋白水平、腫瘤大小、肝硬化沒(méi)有明顯相關(guān)性。4、與對(duì)照組相比,BEL-7402、SMMC-7721和SK-HEP-1三種細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimics 48小時(shí)后,增殖受到明顯抑制;遷移過(guò)transwell小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少;侵襲過(guò)transwell小室的細(xì)胞數(shù)量也明顯減少。5、miR-214-3p agomir組的動(dòng)物整體活體成像熒光信號(hào)、肺成像熒光信號(hào)和肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量均顯著低于或少于miRcontrol agomir組(P值情況分別為P0.01、P0.05、P0.05)。6、在TargetScan和mi Randa兩大數(shù)據(jù)庫(kù)均顯示HMGA1為miR-214-3p的預(yù)測(cè)靶基因。7、肝癌臨床標(biāo)本的miR-214-3p熒光原位雜交和HMGA1免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-214-3p和HMGA1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-214-3p mimics對(duì)HMGA1 3’-UTR野生型報(bào)告載體組熒光素酶活性產(chǎn)生了明顯抑制作用(P0.01),而對(duì)3’-UTR突變型報(bào)告載體組熒光素酶活性則沒(méi)有明顯影響。8、拯救實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)HMGA1可以減弱轉(zhuǎn)染miR-214-3p mimics對(duì)BEL-7402、SMMC-7721和SK-HEP-1三種肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的抑制作用并接近對(duì)照細(xì)胞水平。結(jié)論:miR-199a-2/214簇中的三個(gè)microRNA成熟體miR-214-3p、199a-5p、199a-3p在肝癌中的表達(dá)均明顯下調(diào);miR-214-3p通過(guò)靶向結(jié)合并下調(diào)HMGA1的表達(dá)來(lái)抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
[Abstract]:Objective : To investigate the role of micro RNA in the development of primary liver cancer . The expression level of miR - 214 - 3P was significantly lower than that of non - tumor liver tissues . Conclusion : The expression of miR - 214 - 3P , 199a - 5p , 199a - 3P in human hepatocellular carcinoma ( HCC ) is significantly lower than that of control cells .
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1915680