本文選題：MAGE-A + 食管鱗狀細胞癌　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：食管癌是世界上高惡性度的腫瘤之一,其腫瘤發(fā)病率排名第八,腫瘤相關病死率排名第六。全世界每年大約有450000人患食管癌,尤其在南美洲和亞洲地區(qū),特別是日本和中國,有較高的發(fā)病率。食管癌的局部侵潤和遠處轉移是引發(fā)該病死亡率的主要原因。由于該病不易發(fā)現,多數患者在臨床確診時,腫瘤已無法切除,或可見遠端轉移灶,無法采用手術治療,因此該病發(fā)病率接近死亡率,其5年生存率也較低,約為15%。在中國和其他的亞洲國家,食管鱗狀細胞癌是最普遍的病理類型。盡管隨著科學的發(fā)展,手術、放療和化療有了很大的進步,但對于提高食管癌患者總體生存率方面并沒有明顯的效果,因此期待新的治療策略。目前,腫瘤免疫治療已經成為腫瘤治療的新趨勢,是繼手術、化療和放療后的又一種腫瘤治療模式。該方法創(chuàng)傷小、針對性強,尤其對于手術療效不佳的腫瘤,可能成為一種較好的選擇。識別高效特異的靶抗原是腫瘤免疫治療的關鍵一步。高效特異性腫瘤抗原必須在腫瘤組織中高表達,且在正常組織中無表達,即表達具有高度限制性,才能避免腫瘤免疫治療過程中發(fā)生自身免疫性疾病。癌睪丸抗原(CTA),因其特異性表達模式成為腫瘤免疫治療的理想靶點,其廣泛表達于各種腫瘤組織中,而在正常組織中僅表達于睪丸生殖細胞,偶而也表達于胎盤組織。由于睪丸是免疫豁免器官,不表達人類白細胞抗原(HLA)分子,不會引起機體特異性免疫反應。因此CTA作為特異性腫瘤免疫治療的靶點,有很好的應用前景。黑色素瘤抗原基因(Melanoma-associated antigen gene,MAGE),是CTA家族成員,是從黑色素瘤細胞中分離出來的一個大家族抗原基因。近年來,導師所在課題組一直致力于研究MAGE家族的生物學功能及其作為腫瘤特異性免疫治療靶分子的可能性。根據MAGE的表達模式,MAGE家族分為兩個亞類,即MAGE-Ⅰ類抗原和MAGE-Ⅱ類抗原。其中MAGE-Ⅰ類抗原為腫瘤特異性抗原,在正常體細胞不表達或很少表達;MAGE-Ⅱ類抗原在正常成人體細胞中均有表達,因此不屬于CTA的范疇。MAGE-Ⅰ類抗原又分為三個亞類,即MAGE-A、MAGE-B和MAGE-C。其中MAGE-A包括12個成員,即MAGE-A1~MAGE-A12。目前關于MAGE-A亞型基因在食管癌中的表達和調節(jié)及其在食管癌細胞中生物學功能的研究還很少。因此本研究首先采用了PCR及酶切的方法研究了MAGE-A亞型在5種食管鱗狀細胞癌細胞系的基因表達譜,探討了MAGE-A亞型在食管癌細胞中表達的特點和模式;通過去甲基化試劑地西他濱的作用,測定食管癌腫瘤細胞的活性、細胞遷移能力、細胞侵襲能力、細胞周期變化,及侵襲相關蛋白和信號通路蛋白的表達變化,研究了地西他濱對食管癌腫瘤細胞MAGE-A表達譜的調節(jié)作用,及其對腫瘤細胞增殖和侵襲能力的影響;利用si RNA技術沉默Eca109和KYSE170細胞中的MAGE-A基因,研究了MAGE-A基因在食管癌腫瘤細胞中的生物學功能,即對腫瘤細胞增殖活性、遷移侵襲能力和侵襲相關蛋白分子、信號通路蛋白表達的變化;探討了MAGE-A在食管癌腫瘤細胞中的生物學作用及其機制。主要研究內容和結果如下:第一部分五種食管鱗狀細胞癌細胞MAGE-A亞型基因表達譜目的:檢測5種食管鱗狀細胞癌細胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13)中MAGE-A1,A2,A3,A4,A6,A8,A9,A10,A11的基因表達情況。方法:對于MAGE-A8,A9,A10,A11,采用單獨設計引物進行普通PCR進行基因表達鑒定;對于MAGE-A1,A2,A3,A4,A6采用巢式PCR擴增共同片段,并利用擴增片段內不同限制性內切酶位點進行酶切產生大小不同的片段進行MAGE-A亞型進行表達鑒定。結果1五種食管鱗狀細胞癌細胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13),每種至少表達二種MAGE-A亞型基因。2五種食管鱗狀細胞癌細胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13),MAGE-A亞型的表達呈多重表達特征。3五種食管鱗狀細胞癌細胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13)表現為異質性,其MAGE-A亞型的表達各不相同。4五種食管鱗狀細胞癌細胞系(Eca109、KYSE170、TE1、TE10、TE13)中,MAGE-A2表達率為80%;MAGE-A3為40%;MAGE-A8為20%;MAGE-A9為100%;MAGE-A10為80%;MAGE-A11為40%。結論1 MAGE-A亞型在食管鱗狀細胞癌細胞系中有較高表達率。2 MAGE-A亞型在食管鱗狀細胞癌細胞系中表達呈多重性,食管癌腫瘤細胞表現為異質性。3 MAGE-A2、MAGE-A9、MAGE-A10表達率較高,分別為80%、100%和80%。提示:這些分子可作為食管癌腫瘤免疫治療的共同靶點,有利于提高免疫治療效果。第二部分地西他濱對MAGE-A表達的調節(jié)及其對腫瘤細胞功能的影響目的:檢測地西他濱對食管癌腫瘤細胞Eca109中MAGE-A1,A2,A3,A4,A6,A8,A9,A10,A11基因表達的調節(jié)作用;同時測定低濃度地西他濱對Eca109細胞增殖、遷移侵襲及細胞周期的影響。方法:對于MAGE-A8,A9,A10,A11,采用單獨設計引物進行普通PCR進行基因表達鑒定;對于MAGE-A1,A2,A3,A4,A6采用巢式PCR擴增共同片段,并利用擴增片段內不同限制性內切酶位點進行酶切,產生的大小不同片段可進行MAGE-A亞型基因表達的鑒定。低濃度地西他濱處理后,利用MTT方法測定腫瘤細胞增殖能力;利用細胞劃痕實驗測定細胞遷移能力;利用侵襲小室實驗測定細胞侵襲能力;利用細胞流式分析技術測定腫瘤細胞周期變化;利用蛋白印跡技術檢測地西他濱處理后腫瘤細胞侵襲相關蛋白MMP2和信號通路蛋白NF-kB的表達情況。結果1地西他濱調節(jié)MAGE-A亞家族成員在食管癌細胞Eca109的基因表達。Eca109細胞中,MAGE-A亞型基礎表達譜為MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A9、MAGE-A10。0.5mM地西他濱藥物處理后,誘導表達了MAGE-A8和MAGE-A4,而MAGE-A9和MAGE-A10的表達出現了降低。2地西他濱抑制Eca109細胞增殖活性。地西他濱對細胞增殖活性的影響表現為時間依賴性和劑量依賴性。和對照組相比,地西他濱0.5mM處理24小時,細胞增殖活性開始降低;在0.5mM、2.5mM、5mM濃度下,處理組細胞增殖活性分別降低了15%、17.6%、18.2%,隨濃度增高,細胞增殖抑制加強;72小時后,地西他濱組(0.5mM、2.5mM、5mM)細胞增殖活性分別降低18.18%(P0.01)、24.64%(P0.05)、40.13%(P0.05)。3地西他濱抑制Eca109細胞的遷移。和對照組相比,0.5mM地西他濱處理組細胞遷移能力在6小時、12小時、24小時后,分別降低了39.1%(P0.05)、31.7%(P0.01)、34%(P0.01)。4地西他濱抑制Eca109細胞的侵襲。和對照組相比,0.5mM地西他濱處理組48小時后,穿過Transwell小室的細胞數降低了47.2%(P0.05)。5地西他濱誘導Eca109細胞周期G2/M期阻滯。和對照組相比,0.5mM地西他濱處理組,G2/M期的細胞數量占比增多(處理組:31.59±0.89;對照組:27.84±0.22)(P0.05),而在S期細胞數量占比降低(處理組:25.68±0.83;對照組:32.03±1.73)(P0.05);在G0/G1期細胞數量占比沒有顯著性的變化。6地西他濱降低了Eca109細胞NF-kB2和MMP2的表達。和對照組相比,0.5mM地西他濱處理組和1mM地西他濱處理組,NF-kB p-p100蛋白表達分別降低26.77%、36.78%(P0.05);NF-kB p52蛋白表達降低了34.98%、50.63%(P0.05);MMP2表達降低20%、24.26%(P0.05)。結論1低劑量地西他濱能夠抑制Eca109細胞增殖活性,同時低劑量地西他濱誘導了腫瘤細胞發(fā)生細胞周期G2/M期阻滯。提示:低劑量地西他濱誘導Eca109腫瘤細胞發(fā)生細胞周期阻滯,可能導致了腫瘤細胞增殖活性的降低。2低劑量地西他濱能夠降低Eca109細胞遷移和侵襲的能力,同時處理組NF-kB2和MMP2蛋白表達降低。提示:低劑量地西他濱有可能通過降低Eca109細胞MMP2蛋白表達抑制腫瘤細胞遷移侵襲能力,而NF-kB2信號通路有可能參與了該過程。3低劑量地西他濱誘導Eca109細胞中MAGE-A8和MAGE-A4的表達,增加了MAGE-A亞型腫瘤免疫治療抗原靶點。4低劑量地西他濱聯(lián)合MAGE-A靶點免疫治療晚期食管鱗狀細胞癌,有可能成為晚期食管癌患者治療的新策略。第三部分 MAGE-A 的生物學功能及其機制目的:檢測MAGE-A在食管癌腫瘤細胞Eca109和KYSE170中,其對細胞增殖、遷移、侵襲的生物學功能影響,并探討其作用機制。方法:選擇含有針對MAGE-A亞家族保守基因的6種si RNA混合物,利用si RNA沉默技術,研究MAGE-A亞型的生物學功能。采用普通PCR測定MAGE-A8,A9,A10,A11的基因表達沉默效果,采用巢式PCR擴增共同片段測定MAGE-A1,A2,A3,A4,A6基因沉默效果;采用蛋白印跡測定MAGE-A亞型蛋白表達沉默效果。確定MAGE-A si RNA能有效沉默MAGE-A后,利用MTT方法測定腫瘤細胞增殖能力;利用細胞劃痕實驗測定細胞遷移能力;利用侵襲無膠小室和有膠小室實驗測定細胞侵襲能力。利用蛋白印跡技術測定腫瘤細胞內MMP2蛋白和信號通路蛋白p-p38蛋白表達情況;采用p38 MAPK信號通路抑制劑SB203580,檢測p38信號通路是否參與了MAGE-A沉默后腫瘤細胞發(fā)生的生物學效應改變。結果1 MAGE-A si RNA能夠抑制了MAGE-A亞型基因和蛋白表達。和對照組si-scramble相比,轉染了50n M和100n M MAGE-A si RNA的Eca109和KYSE170細胞,其MAGE-A的m RNA和蛋白的表達均降低。轉染100n M MAGE-A si-RNA的細胞組,MAGE-A亞型蛋白表達降低更明顯。提示:實驗采取100 n M轉染si RNA。2沉默MAGE-A基因抑制食管癌細胞的增殖。和對照組相比,轉染100n M MAGE-A si RNA 48小時后,Eca109和KYSE170細胞增殖活性,分別降低了11.26%(P0.05)和12.61%(P0.05)。3沉默MAGE-A基因抑制食管癌細胞遷移能力。和對照組相比,轉染100n M MAGE-A si RNA后,0-24小時遷移能力分別降低了32.97%和41.15%(P0.05)。4沉默MAGE-A基因抑制食管癌細胞的侵襲能力。和對照組相比,轉染100n M MAGE-A si RNA后,兩種腫瘤細胞的侵襲能力在無膠小室中降低了32%和44.55%(P0.05);在有膠小室中降低了51.5%和39.48%(P0.05)。5沉默MAGE-A基因抑制食管癌細胞中MMP2、c-Myc和p-p38的表達。轉染100n M MAGE-A si RNA后,Eca109細胞的c-Myc、MMP2表第三部分MAGE-A的生物學功能及其機制達分別降低19.12%、61.11%(P0.05);KYSE170細胞c-Myc表達降低了47.67%(P0.05)。食管癌細胞Eca109和KYSE170中磷酸化p38水平均降低,分別降低了27.6%和39.45%(P0.05),提示:P38 MAPK信號通路可能參與了MAGE-A基因沉默引發(fā)的腫瘤細胞生物學功能的改變,如細胞增殖活性降低和侵襲能力抑制;腫瘤細胞中MMP2或c-Myc分子可能是p38信號通路的效應分子。6用SB203580阻斷p38MAPK信號通路途徑抑制食管癌細胞侵襲能力、降低細胞MMP2、c-Myc的表達。和對照組相比,2mM SB203580處理48小時后,穿過基質膠包被小室的腫瘤細胞數量顯著減少,侵襲能力分別降低了31.67%和28.2%(P0.05);Eca109和KYSE170細胞中c-Myc的表達都出現了降低,分別降低了27.65%和28.2%(P0.05);Eca109細胞中MMP2降低了19.3%(P0.05)。SB203580處理組,P38信號通路蛋白p-p38和NF-kB2信號通路蛋白p100、p52表達沒有顯著性變化。提示:p38MAPK信號通路阻斷后,細胞生物學效應的改變和沉默MAGE-A基因后效應改變相一致;腫瘤細胞中MMP2和c-Myc可能是p38MAPK信號通路的效應分子;沉默MAGE-A基因有可能通過p38MAPK信號通路途徑,引發(fā)MMP2和c-Myc的降低,抑制了食管癌腫瘤細胞的侵襲能力。結論1沉默MAGE-A抑制食管癌細胞的增殖活性和遷移侵襲能力。2沉默MAGE-A抑制食管癌細胞c-Myc和MMP2的表達。3沉默MAGE-A抑制食管癌細胞p38 MAPK通路蛋白的表達。4在食管癌細胞中,p38MAPK信號通路部分參與了MAGE-A沉默后腫瘤細胞遷移侵襲能力降低的生物學過程。5沉默MAGE-A可能通過抑制食管癌細胞p38MAPK信號通路,降低表達了通路效應分子c-Myc和MMP2,從而抑制了食管癌細胞的增殖活性和遷移侵襲能力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

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本文編號：1914978