本文選題：CCND1 + miR-340�。� 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的結腸癌(colorectal cancer, CRC)是發(fā)生在結腸部位的消化道腫瘤,發(fā)病率有逐漸升高的趨向。其好發(fā)于直腸與乙狀結腸交界處,高危年齡為40～50歲,男女發(fā)病比例為2～3：1。在全球最高影響因子雜志CA-A Cancer Journal for Clinicians最近發(fā)表的2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)中表示,結腸癌為我國最常見的腫瘤之一,嚴重威脅了國人的健康。結腸癌根據(jù)組織學病理類型主要分為腺癌、鱗腺癌、鱗癌和未分化癌,其中,腺癌又包括了幾個亞型,如管狀腺癌、乳頭狀腺癌、黏液腺癌等。結腸癌早期是指原發(fā)灶腫瘤限于粘膜層或粘膜下層者,其治愈率較高,5年生存率已超過80%,而晚期的結腸癌患者由于出現(xiàn)局部淋巴結轉移和遠處器官侵犯,5年生存率低于50%。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個非常復雜的過程,與日常飲食不節(jié)、環(huán)境的污染以及遺傳因素密切相關。其包含各種基因的參與。結腸癌的致病因素很多,目前證據(jù)比較明確的包括：1、30%的結腸癌發(fā)病與遺傳有關；2、不良的飲食習慣,如低纖維、高脂肪、高蛋白飲食,近年來發(fā)病率的升高與近年來我國人民生活水平的提高不無關系：3、不良的排便習慣會使有害物質聚集在結腸癌,從而損傷腸粘膜而致癌。在分子水平方面,結腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制發(fā)生的病因主要有以下幾個方面：修復基因的突變；3、抑癌基因的失活、功能缺失,如管家基因APC突變后失去對β連環(huán)蛋白的調節(jié),從而影響細胞間粘附和相關信號通路；4、原癌基因過表達、激活,如KRAS基因點突變可導致其下游靶蛋白p21的氨基酸的改變,p21的功能出現(xiàn)下降；5、端粒酶長度的改變；6、相關信號通路的異常激活；7、相關凋亡調控紊亂等。細胞周期蛋白Cyclin家族是一類廣泛存在于真核細胞中,在細胞周期進展中可循環(huán)反復地出現(xiàn)-消失-出現(xiàn)的蛋白質,其中,CCND1,也叫CyclinD1,細胞周期蛋白1,屬于高度保守的細胞周期家族蛋白。CCND1的編碼基因定位在11q13上,包含5個外顯子,全長約15kb。在有生長因子的促進下,CCND1最早在細胞周期中被合成,在合成前期的中期到達峰值。CCND1可與細胞周期蛋白依賴性激酶cyclin-dependent kinases (CDKs),如CDK4或者CDK6結合形成復合體并作為它們的調節(jié)亞基,促進細胞周期從G1到S期的轉化,完成對細胞周期進程的調控。此外,研究發(fā)現(xiàn),除了促進細胞分裂外,CCND1還具有一些獨立于CDKs活性的促進基因轉錄的功能。作為大家較早認可的原癌基因,CCND1的異常表達通過調控細胞周期使細胞停滯于合成期引起細胞過度增殖進而導致腫瘤的發(fā)生。在多種腫瘤中,如結腸癌、膀胱癌、生殖系統(tǒng)腫瘤、胃癌、肺癌等,腫瘤組織的CCND1表達明顯高于鄰近正常組織的CCND1表達,且與病理類型、腫瘤臨床分期等指標相關。另外,CCND1在促進腫瘤的侵襲轉移方面,也發(fā)揮著舉足輕重的作用。文獻報導,CCND1的過表達可以在不同腫瘤里,如乳腺癌、胃癌等,促進細胞的侵襲和遷移,導致不良的預后。MicroRNA (miRNAs),是一系列小分子非編碼的單鏈RNA,一般由內源基因編碼的約22個核苷酸組成,主要參與轉錄后基因表達調控。miRNAs有廣泛多樣的生物學功能,它們參與了人體生命過程中一系列的重要進程,包括早期發(fā)育,細胞增殖,細胞凋亡,細胞死亡,脂肪代謝和細胞分化等。miRNAs可以通過識別并互補結合目的基因的3'UTR端來直接靶向目的基因,下調目的基因的表達,調節(jié)相關信號通路,進而發(fā)揮其生物學功能。miRNAs主要通過以下三種方式發(fā)揮抑制靶基因的作用：1、切斷靶基因的mRNA分子：niRNAs通過完全互補地結合靶基因的序列而切斷了靶基因的mRNA;2、阻礙靶基因的翻譯過程：miRNAs可以不影響mRNA的序列,但是可以不完全地結合靶基因的序列進而阻礙靶基因的翻譯過程；3、上述兩種方式同時進行,一方面切斷靶基因mRNA,一方面不完全結合靶基因阻礙翻譯。近年來研究表明,miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中過程中也發(fā)揮了相當大的作用。在各種腫瘤中,我們常�？梢詸z測到多種腫瘤中多種miRNAs的異常表達,包括過表達和表達下調,這種現(xiàn)象也提示我們miRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移等不同的過程中發(fā)揮著不同的作用。從發(fā)揮的功能來說,miRNA事實上可以被當作癌基因或者是抑癌基因來看,如miR-21則通過靶向抑癌基因PTEN促進腫瘤細胞生長,而let-7,作為,miRNAs的一種,可以通過靶向調控其下游RAS蛋白來發(fā)揮其抑癌的作用。更為重要的是,miRNAs還與細胞對化療藥物的敏感性有關,如在卵巢癌中,過表達的miR-214通過作用于其下游靶基因PTEN,進而導致PTEN的表達下調,從而激活AKT信號轉導通路,促進細胞的增殖,導致患者對順鉑(cisplatin)化療的不敏感。5-Fu,5-氟尿嘧啶,即胸苷酸合成酶抑制藥,為臨床上治療常見實體瘤,如結腸癌、乳腺癌、胃癌的常用化療藥物。5-Fu作為抗代謝類化合物,5-Fu進入體內后可轉變?yōu)?-氟尿嘧啶脫氧核苷酸(5F-dUMP),可抑制脫氧胸苷酸合成酶,抑制脫氧尿苷酸(dUMP)甲基化轉變?yōu)槊撗跣剀账?dTMP)的進程,進而達到干擾DNA的合成和修復的作用。另外,在體內還可轉化為5-氟尿嘧啶核苷,以偽代謝產(chǎn)物形式與RNA整合,干擾蛋白質的合成,導致細胞的凋亡。腫瘤耐藥性(drug resistance, DR),導致患者對化療不敏感,是化療失敗的主要原因之一,他的發(fā)生是非常復雜的,需要各種因素參與、共同作用。雖然5-Fu作為惡性消化道腫瘤治療的一線藥物,但是由于腫瘤耐藥問題的出現(xiàn),治療的總體效果并不是很好。導致5-氟尿嘧啶耐藥的原因很多,包括藥物活化障礙、體內轉運、攝取功能失控、作用靶點酶的數(shù)量及活性、代謝異常等。如黏蛋白MUC1(mucinl)的過度表達可以抑制胰腺癌細胞對5-Fu的攝入減少進入導致5-氟尿嘧啶的作用效果減弱,腫瘤細胞對5-Fu的敏感性降低。研究目的分析CCND1在結腸癌組織及正常腸組織中的表達特性;研究干擾CCND1后結腸癌細胞對5-Fu敏感性的變化;研究miR340調控結腸癌細胞對5-Fu的敏感性的影響；驗證CCND1為miR340的直接靶向基因。研究內容與方法1.CCND1在結腸癌組織及正常腸組織中表達特性1)用實時熒光定量RT-qPCR技術檢測CCND1在結腸癌組織及正常腸組織中mRNA水平表達差異；2)采用western-blotting技術檢測CCND1在結腸癌組織及癌旁組織中的蛋白水平表達差異；3)IHC觀察CCND1蛋白在結腸癌癌癥組織和其對應的癌旁組織的表達情況。2.研究經(jīng)干擾CCND1作用后,結腸癌細胞對5-Fu的敏感性的變化1)采用siRNA干擾技術,將3個攜帶干擾CCND1序列的siRNA和對應negtive control的siRNA分別轉到2個結腸癌細胞株HCT116和SW480中,通過RT-qPCR和western-blotting在RNA水平和蛋白水平驗證干擾效率,篩選出干擾效率最高的片段,進行后續(xù)實驗;2)鋪96孔板,將干擾CCND1的HCT116和SW480細胞和相應的negtive control細胞分別接種到孔板中,加入5-Fu后檢測IC50值,觀察藥物濃度反應效果。3.研究miR340對結腸癌細胞對5-Fu的敏感性的影響1)利用瞬時轉染技術,將miR340的mimic分別轉入HCT116和SW480細胞中,RT-qPCR檢測瞬轉效率；2)鋪96孔板,將過表達miR340 mimic的SW480細胞和negtive control細胞分別接種到孔板中,加入5-Fu后檢測IC50值,觀察藥物濃度反應效果。4.驗證CCND1為miR340的直接靶向基因1)在兩株結腸癌細胞HCT116和SW480中轉染miR-340的mimic,48小時后RT-qPCR和western-blotting檢測CCND1的mRNA水平及蛋白水平;2)在兩株結腸癌細胞HCT116和SW480中轉染miR-340的inhibitor,48小時后RT-qPCR和western-blotting檢測CCND1的mRNA水平及蛋白水平3)用生物預測軟件預測到CCND1可能為miR-340的靶基因,miR-340可結合到CCND1的3'UTR端；4)用雙熒光素酶報告顯示miR-340可直接靶向CCND1。5.統(tǒng)計學分析：采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對結果得到的數(shù)據(jù)采取統(tǒng)計檢測P值,計量資料的數(shù)值用x±s來顯示。①實時熒光定量PCR檢測各種癌和癌旁組織或結腸癌細胞表達量的2-ΔΔC t值的統(tǒng)計使用單因素方差分析方法(ONEWAY ANOVA),如有統(tǒng)計學意義,進行多重比較,采用Dunnett方法；②生存分析用單因素Cox回歸模型,再用多因素Cox回歸模型確定各參數(shù)是否可作為獨立預后因素；兩組間率的比較采用四格表卡方檢驗)；③噻唑藍方法觀察藥物濃度反應曲線,應該拿析因設計資料的方差分析進行數(shù)據(jù)處理,結果如果有統(tǒng)計學差異,不同組別之間同一個藥物濃度的OD值比較采用unpaired t test,同一個組不同藥物濃度測出來的OD值采用One-Way ANOVA方法分析,如果存在統(tǒng)計學上的差異,不同的藥物濃度之間的兩兩比較使用Dunnett統(tǒng)計學方法；④不同處理組間的比值、穿膜細胞數(shù)等指標采用兩獨立樣本t檢驗；以P0.05認定為其結果具有統(tǒng)計學差異。研究結果1.與正常腸組織相比,CCND1的表達量在癌組織中顯著偏高,且卡方檢驗得出表達量與T分期相關(即Ⅲ-Ⅳ期的患者CCND1的表達明顯高于Ⅰ-Ⅱ期的患者),與年齡、性別、N分期、臨床分期無關。單因素和多因素Cox回歸分析得出年齡、N分期與CCND1的表達量可作為獨立預后因素。1)通過RT-qPCR檢測癌組織及對應癌旁組織中CCND1mRNA含量,發(fā)現(xiàn)癌組織的mRNA水平明顯高于癌旁組織mRNA水平(P0.01),數(shù)據(jù)統(tǒng)計應用兩獨立樣本t檢驗,結果有統(tǒng)計學意義;2)通過western-blotting檢測癌組織及對應癌旁組織中CCND1蛋白含量,以GADPH為內參,發(fā)現(xiàn)癌組織的CCND1蛋白含量明顯高于癌旁組織；3)IHC結果顯示,CCND1主要在核表達。與癌旁組織相比,CCND1在癌組織中染色更深,表達細胞比例更多,統(tǒng)計學分析其在兩種組織中的表達有顯著性差異(P0.01)。CCND1表達量與臨床參數(shù)之間相關性的統(tǒng)計學分析證明,CCND1的表達量與T分期顯著相關(P0.01),即III-IV期的患者CCND1的表達明顯高于I-H期的患者,而與性別、年齡、N分期、臨床分期無關(P值分別為0.484,0.774,0.135,0.503)；4)經(jīng)單因素生存分析,年齡、CCND1表達量和N分期都可影響患者的總體生存時間,年齡65歲患者預后差于年齡65歲患者(P0.01),CCND1高表達的患者預后差于低表達者(P0.01),NO患者預后明顯好于N1-N2患者(P0.01)。多因素生存分析結果表示,年齡(P0.01)、CCND1表達量(P0.05)以及N分期(P0.01)可以作為患者預后的獨立影響因素,而性別、T分期和臨床分期(P值分別為0.723,0.262,0.132)均不構成獨立影響因素。2.干擾CCND1后,結腸癌細胞對5-Fu的敏感性增加1)采用SiRNA干擾技術,將攜帶干擾CCND1序列的3個siRNA和對應negtive controlsiRNA分別轉到2個結腸癌細胞株HCT116和SW480中,分別于轉染后的24小時、48小時通過RT-qPCR和western-blotting來驗證CCND1在RNA和蛋白水平的干擾效率,篩選出干擾效率最高的2號片段,48小時的干擾效率分別達79%和68%,故在后續(xù)的試驗中,選定2號片段,干擾48小時作為實驗標準;2)鋪96孔板,將干擾CCND1的HCT116和SW480細胞和相應的negtive control細胞分別接種到孔板中,加入5-Fu作用48小時后檢測2組細胞的IC50值,觀察藥物濃度反應效果。結果顯示,干擾CCND1后,HCT116和SW480的IC50值均有下降,HCT116細胞的siCCND1組IC50值約為10uM, negtive control組的IC50值為20uM, SW480細胞的siCCND1組IC50值也約為10uM, negtive control組的IC50值約為20uM。經(jīng)siCCND1干擾后,兩株細胞對5-Fu的敏感性均有增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.過表達miR-340后,結腸癌細胞對5-Fu的敏感性增加1)利用瞬時轉染技術,將miR-340的mimic轉入結腸癌細胞株HCT116和SW480細胞中,RT-qPCR檢測瞬轉效率分別高于對應negtive control3倍和4倍(P0.01)；2)鋪96孔板,將過表達miR340 mimic的HCT116和SW480細胞及對應的negtivecontrol細胞分別接種到孔板中,加入5-Fu后48小時檢測IC50值,觀察藥物濃度反應效果。結果顯示,過表達miR-340后,HCT116和SW480的IC50值均有下降,HCT116中siCCND1組IC50值約為10uM,對照為20uM, SW480中siCCND1組IC50值也約為10uM,對照約為20uM。兩株細胞對5-Fu的敏感性均有增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.驗證CCND1為miR-340的直接靶向基因1)在兩株結腸癌細胞HCT116和SW480中轉染miR-340的mimic,48小時后RT-qPCR和western-blotting檢測CCND1的mRNA水平及蛋白水平,結果顯示兩株細胞中CCND1表達水平均明顯下降(P0.01)；2)在兩株結腸癌細胞HCT116和SW480中轉染miR-340的inhibitor,48小時后RT-qPCR和western-blotting檢測CCND1的mRNA水平及蛋白水平均有上升(P0.05)；3)用生物預測軟件預測到CCND1可能為miR-340的靶基因,miR-340可結合到CCND1的3'UTR端；4)雙熒光素酶報告顯示miR-340可直接靶向CCND1。結論CCND1在結腸癌中高表達,其表達量與T分期相關(即III-IV期的患者CCND1的表達明顯高于I-II期的患者),且年齡、N分期與CCND1的表達量可作為獨立預后因素。干擾CCND1后,發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞對5-Fu的敏感性增加,同樣,過表達miR-340后細胞對5-Fu的敏感性也顯著增加。通過生物軟件預測及雙熒光素酶報告證實,miR-340可以直接靶向CCND1。換句話說,CCND1可以受miR-340的抑制從而影響結腸癌細胞對5-Fu的敏感性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35

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7 宋e，

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