本文選題：Annexin7 + 調(diào)控　； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景:腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞從原生腫瘤位點(diǎn)(也稱為原生腫瘤)向次生腫瘤位點(diǎn)轉(zhuǎn)移的過(guò)程。腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制非常復(fù)雜,有多重因素可以導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。粘附,擴(kuò)散,轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要三個(gè)步驟,不同基因和蛋白通路在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的影響也不同。淋巴癌轉(zhuǎn)移是一種更為復(fù)雜的過(guò)程,包含了多種影響因素,都可導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至淋巴系統(tǒng)。所有淋巴轉(zhuǎn)移的腫瘤都是惡性的,并且淋巴癌轉(zhuǎn)移常常是高致死率的誘因。肝癌(HCC)作為一種全球高致死率的疾病,位列世界惡性腫瘤排行第二位,全球已有746,000位患者因肝癌而去世。HCC流行病和地方病區(qū)域集中在東亞,北非和西非,以及歐洲和美洲的一些區(qū)域。HCC最大的挑戰(zhàn)是與高度血管瘤及顯性異質(zhì)多細(xì)胞系疾病相互作用,導(dǎo)致了傳統(tǒng)的化療藥物無(wú)效。HCC患者的早期診斷對(duì)于提高患者的生存率及生活質(zhì)量非常關(guān)鍵。Ezrin和Annexin7(A7)在癌癥轉(zhuǎn)移中起到重要的作用。然而,Ezrin和A7在淋巴癌轉(zhuǎn)移和肝癌轉(zhuǎn)移中的研究工作并不充分。為了完善這部分工作,我們實(shí)驗(yàn)室致力于找到一種新型標(biāo)志物,這將幫助我們?cè)谠缙谠\斷或治療肝癌、淋巴癌轉(zhuǎn)移的疾病中提供新的靶點(diǎn),這項(xiàng)研究也應(yīng)用于評(píng)價(jià)Ezrin作為疾病診斷、預(yù)防LNMHCC的一種生物標(biāo)志物。Subcellular fraction是一種改變最多、最為高效的生物技術(shù)手段,幫助找到疾病的細(xì)胞基因和蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn)也有助于幫助研究這些細(xì)胞基因和蛋白的實(shí)際作用以及他們之間的相互聯(lián)系。此外,Subcellular fraction也有助于尋找到低復(fù)制數(shù)目的蛋白質(zhì)及分辨蛋白質(zhì)的功能,并且確定它們的生物活性核酸合成過(guò)程氧化還原酶蛋白質(zhì)細(xì)胞骨架信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路細(xì)胞結(jié)構(gòu)和核苷流動(dòng)性局部粘貼等等。本研究旨在研究Ezrin表達(dá)在高淋巴癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞系(Hca-F70%)及低淋巴轉(zhuǎn)移細(xì)胞系(Hca-P30%),HCC細(xì)胞線性的表達(dá)及A7對(duì)Ezrin表達(dá)效果的影響。目的:1、了解Ezrin在淋巴道轉(zhuǎn)移肝癌(LNM-HCC)在體內(nèi)和體外細(xì)胞和組織中的表達(dá)規(guī)律。2、研究A7對(duì)Ezrin在不同水平上的影響及在LNM-HCC體內(nèi)、體外細(xì)胞功能的影響。3、比較Ezrin在不同類型的LNM-HCC亞細(xì)胞組分中的表達(dá)。4、評(píng)價(jià)Ezrin的在體內(nèi)、體外腫瘤組織中的表達(dá)能否作為診斷和預(yù)防LNM-HCC的生物標(biāo)志物。方法:利用同種基因型實(shí)驗(yàn)鼠,高淋巴癌轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系(Hca-F70%轉(zhuǎn)移)和低淋巴癌轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系(Hca-P30%轉(zhuǎn)移),近親繁殖的615鼠,分別作為體內(nèi)、體外模型。Hca-F和Hca-P兩種細(xì)胞株用液氮復(fù)蘇,并且用無(wú)菌PBS洗滌三次,將10%無(wú)菌FBS加入無(wú)菌1460細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí),5%CO2連續(xù)通氣24小時(shí),保持溫度為37℃。在Hca-F細(xì)胞株中上調(diào)A7表達(dá)(A7-c DNA-Hca-F),并且在Hca-P設(shè)計(jì)A7基因沉默細(xì)胞株(A7-sh RNA-Hca-P)。Geneticin 418(G 418)藥物400μg/μl(在細(xì)胞培養(yǎng)液中)使用三周,來(lái)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。q RT-PCR及western blot用于證明A7基因和蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。此外,q RT-PCR、western blot、免疫細(xì)胞組織化學(xué)、免疫熒光等技術(shù)也用來(lái)檢測(cè)Ezrin和Annexin 7基因和蛋白質(zhì)在母系細(xì)胞系上轉(zhuǎn)換的表達(dá)。另外,遷徙和入侵實(shí)驗(yàn)也可應(yīng)用于研究我們感興趣的蛋白質(zhì)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象所起的作用。將不同組細(xì)胞以2 x 106細(xì)胞/鼠注射到每組615鼠的足墊。將處理過(guò)的鼠飼養(yǎng)5周,在第五周后采集原生腫瘤和次生腫瘤組織加入蘇木精伊紅后研究組織形態(tài)學(xué)改變,Ezrin表達(dá)用免疫組化的方法,利用q RT-PCR和western blot對(duì)原生腫瘤和次生腫瘤進(jìn)行評(píng)價(jià),另外,血漿中的Ezrin表達(dá)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):結(jié)果表明,q RT-PCR和western blot結(jié)果顯示A7穩(wěn)轉(zhuǎn)后,成功構(gòu)建上調(diào)Hca-F細(xì)胞系(高淋巴道轉(zhuǎn)移)和下調(diào)Hca-P細(xì)胞系(低淋巴道轉(zhuǎn)移)。用于動(dòng)物模型所構(gòu)建的細(xì)胞在第10天加入A7。亞細(xì)胞成功分離后,采用哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)提取方法來(lái)提取五種亞細(xì)胞組分:細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核核膜、核仁和組蛋白帶、細(xì)胞骨架。在淋巴道轉(zhuǎn)移性肝癌的表達(dá)中,我們發(fā)現(xiàn),Ezrin表達(dá)與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)Ezrin和A7在不同HCC細(xì)胞株中表現(xiàn)出顯著差異的蛋白表達(dá),但是,不同的亞細(xì)胞位置Ezrin和A7相關(guān)淋巴道轉(zhuǎn)移水平不同;可以解釋Ezrin和A7在不同的細(xì)胞中生物活性及細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力相關(guān)聯(lián)。此外,增加Ezrin的表達(dá)在A7下調(diào)細(xì)胞與Ezrin表達(dá)減少與A 7上調(diào)細(xì)胞呈顯著相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)可以確認(rèn)A 7基因具有腫瘤抑制作用。此外,Ezrin表達(dá)與HCC腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)、Ezrin與A7呈正相關(guān)(P0.05)。不同轉(zhuǎn)移水平的淋巴轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株免疫印跡分析顯示Ezrin表達(dá)在HcaP(低淋巴道轉(zhuǎn)移)均高于Hca-F(高淋巴轉(zhuǎn)移),差異顯著(p=0.0046)。細(xì)胞分離分析顯示Ezrin的表達(dá)高度存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及Hca-F的細(xì)胞骨架。然而,在細(xì)胞膜、細(xì)胞核和Hca-P細(xì)胞骨架中A7上調(diào)抑制Ezrin的表達(dá)(p=0.0248)并增加遷移和入侵的能力,而Ezrin主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。Hca-P中A7下調(diào)細(xì)胞Ezrin表達(dá)增強(qiáng)(p0.0001)。Ezrin表達(dá)主要集中于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,并且抑制腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲。體外實(shí)驗(yàn)，

本文編號(hào)：1900376