本文選題：膠質(zhì)瘤 + HMGA2��； 參考：《山東大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是成人最常見且惡性程度最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一,其發(fā)病率約為3/100,000,在美國每年的確診人數(shù)約為23,000人。 WH02007中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)將其定義為惡性程度最高級別的IV級腫瘤。受發(fā)病部位及其高度侵襲性特點所限,手術(shù)治療很難確定腫瘤邊界并全部切除,即使達(dá)到肉眼全切并結(jié)合術(shù)后高強(qiáng)度放射治療和化學(xué)治療,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存時間僅有12至15個月。因此,針對多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的新治療方案一直是臨床醫(yī)師和腫瘤學(xué)家研究的熱點。近年來,隨著對腫瘤細(xì)胞的異常高增殖性在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機(jī)制中的重要作用的發(fā)現(xiàn),基因治療越來越引起大家的關(guān)注,并在一系列臨床前實驗中取得了一定進(jìn)展。然而,目前仍未發(fā)現(xiàn)合適的治療靶點。在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子中,高遷移率蛋白家族A2(High mobility group A2,HMGA2)被認(rèn)為是起關(guān)鍵作用的因子之一。高遷移率蛋白家族(High mobility group proteins, HMGs)屬于已知成員最多且研究較為完善的非組蛋白質(zhì)染色體蛋白家族。HMGs具有分子量小、功能強(qiáng)大等特點,因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的高遷移速率而得名。HMGs主要包括HMGA、HMGB和HMGN。HMGA又主要包括HMGA1和HMGA2,其中,HMGA2是目前研究最為廣泛和受關(guān)注程度最高的成員。HMGA2可以通過其特有的AT結(jié)合區(qū)域與DNA結(jié)合并通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)DNA的轉(zhuǎn)錄。HMGA2在胚胎組織中廣泛表達(dá),在成人體內(nèi)所有分化成熟的組織,包括心臟、腦組織、肝臟、胰臟、各種血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中幾乎無表達(dá)或僅有微量表達(dá)。然而目前發(fā)現(xiàn)HMGA2在多種人類腫瘤尤其是惡性腫瘤中幾乎都有表達(dá),例如甲狀腺癌、直腸癌和乳腺癌等。并且HMGA2與腫瘤的增殖性以后患者的惡性預(yù)后密切相關(guān)。RNA干擾技術(shù)主要包括雙鏈RNA(dsRNA)和短發(fā)夾RNA (ShRNA),是基因工程學(xué)自1998年發(fā)現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象后興起且日益成熟的基因沉默技術(shù)。此項技術(shù)的應(yīng)用可以高效穩(wěn)定特異地抑制目標(biāo)基因的表達(dá),從而達(dá)到針對目的基因理想的沉默效果。目前,RNA干擾技術(shù)特別是shRNA已被成功應(yīng)用于基因功能研究、癌癥等疾病的發(fā)病機(jī)理和基因治療等生命科學(xué)領(lǐng)域。本研究目的是：首先,檢測HMGA2在成人正常腦組織及各WHO病理分級惡性膠質(zhì)瘤包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的蛋白表達(dá),探討HMGA2與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖性的相關(guān)性以及它們之間的內(nèi)在聯(lián)系,并通過隨訪和生存分析探討HMGA2高表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的相關(guān)關(guān)系。然后,通過設(shè)計在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中穩(wěn)定高效表達(dá)的慢病毒介導(dǎo)的靶向HMGA2的ShRNA載體,研究該重組載體對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞HMGA2的干擾效果,并進(jìn)一步明確干擾前后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力變化,以及通過動物體內(nèi)實驗研究HMGA2抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長速率的影響,以期探討HMGA2是否可成為未來進(jìn)行膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療研究的有效靶點。的增殖性以后患者的惡性預(yù)后密切相關(guān)。RNA干擾技術(shù)主要包括雙鏈RNA(dsRNA)和短發(fā)夾RNA (ShRNA),是基因工程學(xué)自1998年發(fā)現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象后興起且日益成熟的基因沉默技術(shù)。此項技術(shù)的應(yīng)用可以高效穩(wěn)定特異地抑制目標(biāo)基因的表達(dá),從而達(dá)到針對目的基因理想的沉默效果。目前,RNA干擾技術(shù)特別是shRNA已被成功應(yīng)用于基因功能研究、癌癥等疾病的發(fā)病機(jī)理和基因治療等生命科學(xué)領(lǐng)域。本研究目的是：首先,檢測HMGA2在成人正常腦組織及各WHO病理分級惡性膠質(zhì)瘤包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的蛋白表達(dá),探討HMGA2與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖性的相關(guān)性以及它們之間的內(nèi)在聯(lián)系,并通過隨訪和生存分析探討HMGA2高表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的相關(guān)關(guān)系。然后,通過設(shè)計在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中穩(wěn)定高效表達(dá)的慢病毒介導(dǎo)的靶向HMGA2的ShRNA載體,研究該重組載體對于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞HMGA2的干擾效果,并進(jìn)一步明確干擾前后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力變化,以及通過動物體內(nèi)實驗研究HMGA2抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長速率的影響,以期探討HMGA2是否可成為未來進(jìn)行膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療研究的有效靶點。第一部分HHGA2在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系目 的HMGA2是高遷移率蛋白家族非常獨(dú)特的成員,其基因在腫瘤中的表達(dá)增加與多種腫瘤細(xì)胞的增殖性和患者惡性預(yù)后關(guān)系密切。本研究目的是檢測HMGA2基因在正常腦組織和惡性膠質(zhì)瘤中的蛋白表達(dá),并探討HMGA2與惡性膠質(zhì)瘤增殖性和侵襲性的相關(guān)性；HMGA2與MMP-2和MIB標(biāo)記系數(shù)(MIB-LI)之間的聯(lián)系以及HMGA2與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的相關(guān)關(guān)系。方法1.標(biāo)本收集2010年10月-2013年5月期間山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科的原發(fā)惡性膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本78例以及正常腦組織(取自腦內(nèi)血腫清除術(shù)患者)7例,其中女性41例(年齡21-78歲,平均年齡43.3±4.3歲),男性37例(年齡16-83歲,平均年齡44.5±3.5歲)。惡性膠質(zhì)瘤患者包括星形細(xì)胞瘤27例(WHO II級),間變性星形細(xì)胞瘤25例(WHO III級),多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤26例(WHO IV級)。所有病例診斷均由術(shù)后的病理證實,并得到山東省立醫(yī)院病理科的診斷。所有患者術(shù)前均未接受手術(shù)或者放化療,星形細(xì)胞瘤患者術(shù)后未行放化療,間變性星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者術(shù)后均接受放化療。手術(shù)標(biāo)本部分保存于4%多聚甲醛,部分于-80'C保存以提取mRNA和蛋白質(zhì)。2. 免疫組織化學(xué)染色方法采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(S-P)法,在標(biāo)準(zhǔn)實驗流程下操作,檢測HMGA2、MMP-2和Ki-67蛋白在正常腦組織和不同WHO分級惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá),以及他們之間的相關(guān)性。3.結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)半定量免疫組織化學(xué)法評價HMGA2反應(yīng)陽性細(xì)胞顯色比例和強(qiáng)度。在光學(xué)顯微鏡高倍視野(×400)下,每張切片隨機(jī)選擇5個視野進(jìn)行觀察,計數(shù)每200個腫瘤細(xì)胞中免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞所占百分比。每張病理切片分別有4名實驗者在雙盲的前提下單獨(dú)進(jìn)行評價。對于有分歧的結(jié)果,由實驗者在雙頭顯微鏡下重復(fù)評價,直至達(dá)到一致。HMGA2表達(dá)評估：強(qiáng)陽性(+++)：陽性細(xì)胞比例大于65%或顯色深(深棕褐色)；中度陽性(++)：陽性細(xì)胞比例介于30%至65%之間或染色略深(黃褐色)；弱陽性(+)：陽性細(xì)胞比例小于30%或顯色淺(淺黃色)；陰性(-)：無陽性細(xì)胞染色。4.測定HMGA2、MMP-2和Ki-67 mRNA水平和蛋白表達(dá)量提取組織中總mRNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),采用實時熒光定量(qRT-PCR)法檢測7例正常腦組織和29例惡性膠質(zhì)瘤組織中HMGA2、MMP-2和Ki67等目的基因的mRNA表達(dá)情況。提取組織中總蛋白,使用Western blot法檢測HMGA2蛋白表達(dá)。5.生存分析將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者根據(jù)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行分組：強(qiáng)陽性(+++)和中度陽性(++)為強(qiáng)表達(dá)組,弱陽性(+)和陰性(-)為弱表達(dá)組。對兩組患者進(jìn)行隨訪并進(jìn)行生存分析。6.統(tǒng)計學(xué)處理用Fisher精確檢驗分析HMGA2在不同WH0分級惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。Spearman等級相關(guān)分析用于檢驗HMGA2與MMP-2、Ki-67以及患者年齡和性別的關(guān)系。Kaplan-Meier法繪制生存曲線,并應(yīng)用log-rank法進(jìn)行生存分析。所有統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS(19.0版本)統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。設(shè)定P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果HMGA2在正常腦組織中無表達(dá),在惡性膠質(zhì)瘤中可見強(qiáng)弱不等的細(xì)胞核著色。HMGA2在膠質(zhì)瘤組織中總的陽性(率)為92.3%(72/78)。HMGA2與膠質(zhì)瘤惡性程度存在顯著性差別：在間變性星形細(xì)胞瘤(P=,037)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中(P=.007)的表達(dá)高于星形細(xì)胞瘤,然而在間變性星形細(xì)胞瘤與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤間未發(fā)現(xiàn)明顯差別(P-.862)。HMGA2的表達(dá)與Ki-67(r=0.415, P.01)和MMP-2(r=0.363,P.01)存在相關(guān)性,但是未發(fā)現(xiàn)其與患者年齡(r=-0.073,P=.525)和性別(r=0.415, P.01)存在相關(guān)關(guān)系。另外,qRT-PCR結(jié)果顯示HMGA2 mRNA在間變性星形細(xì)胞瘤(1.98倍,P=.029)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(2.56倍,P.01)中的表達(dá)高于星形細(xì)胞瘤,然而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與間變性星形細(xì)胞瘤間未發(fā)現(xiàn)明顯差別(1.29倍,P=.118)。 HMGA2 mRNA表達(dá)與MMP-2(r=0.432,P=.010)和Ki-67(r=0.386,P.039)之間存在相關(guān)關(guān)系。Western blot結(jié)果顯示HMGA2蛋白在間變性星形細(xì)胞瘤(P.01)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(P.01)中的表達(dá)高于星形細(xì)胞瘤,在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)也顯著高于間變性星形細(xì)胞瘤(P=.028)。在正常腦組織中見微量表達(dá)。HMGA2高表達(dá)組膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后差于低表達(dá)組(P.05)。結(jié)論1.HMGA2在正常腦組織中幾乎無表達(dá)。2.HMGA2在不同WHO病理級別惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)有顯著性差異,HMGA2的表達(dá)與WHO分級相關(guān),同時HMGA2與MMP-2和Ki-67的表達(dá)間的相關(guān)性存在統(tǒng)計學(xué)意義,提示HMGA2與膠質(zhì)瘤增殖性和侵襲性存在相關(guān)關(guān)系,HMGA2免疫組織化學(xué)染色有助于不同惡性膠質(zhì)瘤的診斷。3.在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中,HMGA2高表達(dá)組患者的生存預(yù)后差于低表達(dá)組,提示HMGA2表達(dá)可以作為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的有效臨床預(yù)后指標(biāo)。色有助于不同惡性膠質(zhì)瘤的診斷。3.在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中,HMGA2高表達(dá)組患者的生存預(yù)后差于低表達(dá)組,提示HMGA2表達(dá)可以作為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的有效臨床預(yù)后指標(biāo)。第二部分設(shè)計合成并篩選針對HMGA2有效的ShRNA慢病毒載體目 的設(shè)計并合成3組靶向HMGA2基因的ShRNA載體,進(jìn)行慢病毒包裝和提取,并驗證干擾效率,篩選出其中2組有效的慢病毒載體,為下一步的研究做準(zhǔn)備。方法1.設(shè)計合成ShRNA載體并進(jìn)行慢病毒包裝運(yùn)用公眾網(wǎng)站設(shè)計軟件,靶向人類INGA2靶基因序列,設(shè)計3組ShRNA載體,并驗證其特異性,分別編號為1#,2#,3#；1組陰性對照空白載體,編號為0#。然后進(jìn)行測序比對。結(jié)果顯示四組載體均被構(gòu)建成功,測序結(jié)果證實無誤。應(yīng)用工具細(xì)胞株(人類胚胎腎細(xì)胞株HEK293T)進(jìn)行慢病毒包裝并離心提取包裝成功的慢病毒顆粒,然后進(jìn)行病毒滴度測定。2.分別利用ShRNA慢病毒載體1#、2#轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(U251細(xì)胞)培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞(即U251細(xì)胞),轉(zhuǎn)染前一天將目的細(xì)胞分入6一孔培養(yǎng)板培養(yǎng),轉(zhuǎn)染當(dāng)天按實驗設(shè)計的組別分別利用shRNA載體1#、2#和對照空白載體0#進(jìn)行膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗。3.嘌呤霉素篩選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株將細(xì)胞稀釋到1000個細(xì)胞/ml,在0.2μg/ml-5 μg/ml的嘌呤霉素濃度范圍內(nèi)進(jìn)行篩選,選擇出在10-14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度(1 μg/ml)來進(jìn)行下一步的篩選試驗。在轉(zhuǎn)染24小時之后開始加嘌呤霉素(1μg/ml)進(jìn)行篩選。隨著細(xì)胞代謝,嘌呤霉素的濃度和活性會逐漸下降,因此每3-5天更換一次含嘌呤霉素的篩選液。熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況,14天后,即可篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,并后續(xù)置于含嘌呤霉素0.2μg/ml的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。4.驗證沉默目的基因效果,篩選有效慢病毒載體。選出轉(zhuǎn)染效率為90%左右的組,采用qRT-PCR和western blot的方法檢測HMGA2基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況,進(jìn)而判斷不同靶點的干擾效果,篩選出1組有效載體。結(jié)果1.在3組實驗組shRNA載體中,1#、2#、3#轉(zhuǎn)染效率分別為89.4±6.5%、93.6±5.7%、78.6±12.3%；陰性對照空白載體0#的轉(zhuǎn)染效率為96.1±5.4%。2.3個靶點均對HMGA2有沉默效果。與陰性對照載體0#對比,實驗載體1#,2#,3#沉默效率分別為78.3%、82.4%、50.6%。綜合轉(zhuǎn)染效率與沉默效果,1#、2#載體為理想靶點,我們在其中選取了載體1#進(jìn)行下一步實驗。結(jié)論1_本部分實驗成功設(shè)計并構(gòu)建了3組特異性靶向人類HMGA2基因的ShRNA慢病毒載體,病毒滴度較高,可以滿足下一步的實驗要求。2.從3組重組載體中,根據(jù)靶向基因的mRNA和蛋白質(zhì)沉默效率,篩選出2組靶向HMGA2的高效率慢病毒載體,為下一步靶向人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株的HMGA2基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染沉默提供了可靠有效的實驗基礎(chǔ)。HMGA2基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況,進(jìn)而判斷不同靶點的干擾效果,篩選出1組有效載體。結(jié)果1.在3組實驗組shRNA載體中,1#、2#、3#轉(zhuǎn)染效率分別為89.4±6.5%、93.6±5.7%、78.6±12.3%；陰性對照空白載體0#的轉(zhuǎn)染效率為96.1±5.4%。2.3個靶點均對HMGA2有沉默效果。與陰性對照載體0#對比,實驗載體1#,2#,3#沉默效率分別為78.3%、82.4%、50.6%。綜合轉(zhuǎn)染效率與沉默效果,1#、2#載體為理想靶點,我們在其中選取了載體1#進(jìn)行下一步實驗。結(jié)論1_本部分實驗成功設(shè)計并構(gòu)建了3組特異性靶向人類HMGA2基因的ShRNA慢病毒載體,病毒滴度較高,可以滿足下一步的實驗要求。2.從3組重組載體中,根據(jù)靶向基因的mRNA和蛋白質(zhì)沉默效率,篩選出2組靶向HMGA2的高效率慢病毒載體,為下一步靶向人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞株的HMGA2基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染沉默提供了可靠有效的實驗基礎(chǔ)。第三部分慢病毒介導(dǎo)RNA i沉默HMGA2基因?qū)δz質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響目 的利用構(gòu)建好的高度特異性和轉(zhuǎn)染率的攜帶靶向HMGA2 ShRNA的慢病毒載體1#轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251,并通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,研究它們介導(dǎo)RNA干擾對人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251增殖和侵襲的影響及其意義。方法1.CCK-8檢測細(xì)胞增殖水平培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U251細(xì)胞)。按實驗設(shè)計的分組(空白對照,陰性對照以及陽性)情況,將細(xì)胞分入96-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。第2天后每24小時進(jìn)行一次CCK-8分析,檢測對RNAi靶點有效干擾后的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖水平變化。2.小室結(jié)合基底膠實驗檢測U251細(xì)胞的細(xì)胞侵襲培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U251細(xì)胞)。按實驗設(shè)計的分組(空白對照,陰性對照以及陽性)情況,進(jìn)行鋪matrigel膠的小室實驗分析,檢測對RNAi靶點有效干擾后的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲能力的變化。3.小室實驗檢驗U251細(xì)胞株的細(xì)胞遷移能力。培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且己穩(wěn)定轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(U251細(xì)胞)。按實驗設(shè)計的分組(空白對照,陰性對照以及陽性)情況,進(jìn)行小室細(xì)胞遷移實驗分析,檢測對RNAi靶點有效干擾后的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲能力的變化。4. Western blot檢驗MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白變化將轉(zhuǎn)染靶向HMGA2的ShRNA慢病毒載體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染陰性載體的U251細(xì)胞株和正常對照組U251細(xì)胞株進(jìn)行蛋白質(zhì)提取,分別利用Western blot實驗檢測Erk、Jnk和p38蛋白質(zhì)的變化以及磷酸化蛋白質(zhì)的變化。結(jié)果1.CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力實驗結(jié)果表明,實驗組慢病毒載體1#的增殖抑制率(IR)分別為45.2%和40.3%,與陰性對照組和空白對照組相比差異有顯著性(P0.05),這一結(jié)果提示在HM6A2被沉默后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力明顯減弱,腫瘤細(xì)胞的生長能力明顯被抑制。2.通過小室侵襲方法檢測U251細(xì)胞侵襲性,結(jié)果顯示兩個慢病毒載體組對照組比較,在沉默HMGA2基因后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞群體中,侵襲能力明顯降低(P0.05)。3.通過小室遷移方法檢測U251細(xì)胞侵襲性,結(jié)果顯示兩個慢病毒載體組與對照組比較,在沉默HMGA2基因后,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞群體中,遷移能力明顯降低(P0.05)。4. Western blot實驗結(jié)果顯示,Jnk蛋白質(zhì)和p38MAPK蛋白質(zhì)相應(yīng)的磷酸化蛋白降低,而Erk蛋白的磷酸化蛋白p-Erk蛋白表達(dá)升高。結(jié)論1. HMGA2基因?qū)τ谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長和增殖能力具有重要作用；特異性沉默HMGA2基因能引起人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長周期遲緩。2. HMGA2基因?qū)τ谀z質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲性和遷移性同樣具有重要作用；特異性沉默HMGA2基因能有效降低人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251的侵襲能力和遷移能力。3.Jnk和p38MAPK信號通路可能是HMGA2侵襲性和增殖性相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。4.RNA干擾技術(shù)在未來的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療的研究方面具有非常光明的應(yīng)用價值。HMGA2基因能夠作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療的有效靶點。移能力。3.Jnk和p38MAPK信號通路可能是HMGA2侵襲性和增殖性相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。4.RNA干擾技術(shù)在未來的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療的研究方面具有非常光明的應(yīng)用價值。HMGA2基因能夠作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因治療的有效靶點。第四部分超聲微泡介導(dǎo)的靶向HMGA2基因的RNAi慢病毒載體抑制裸鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長的實驗研究目的裸鼠在體實驗驗證靶向HMGA2基因的慢病毒介導(dǎo)的RNAi對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長的抑制作用,并探討超聲微泡技術(shù)輔助介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染效率的有效性。方法接種U251細(xì)胞于24只BALB/C裸鼠皮下并成瘤后,隨機(jī)將其分為4組,每組分別為6只。帶皮下腫瘤模型建瘤成功后,根據(jù)實驗?zāi)康?三個組別分別為超聲微泡+靶向HMGA2的慢病毒介導(dǎo)的RNAi (MB+ShRNA)組、單純慢病毒組(LV)組、單純超聲微泡(MB)組和空白對照(NC)組。MB+ShRNA組每只裸鼠注射慢病毒載體/微泡混合液400gL(含2.5×1010u慢病毒),MB組每只裸鼠注射陰性病毒載體/微泡400μL,LV組每只裸鼠注射慢病毒載體400 μL, NC組每只裸鼠注射D-Hanks液40091。注射實驗試劑后立即在瘤體表面皮膚涂以超聲耦合劑,并給予超聲輻射,用2.5 MHz超聲波,強(qiáng)度2.0W/cm2,每次30s,間隔30s,共計2次60s照射。每3天用游標(biāo)卡尺測量皮下腫瘤長徑(a)及短徑(b)變化,腫瘤體積根據(jù)公式V=π ab2/6計算。15天后采用頸椎脫位法處死小鼠,取瘤并稱重。結(jié)果1.腫瘤的體積、瘤重與抑瘤率(1) MB+ShRNA組、MB+組與NC組動態(tài)觀察至成瘤后第15天,裸鼠皮下種植瘤體積分別為181.7±24.61mm3,303.3±31.44mm3,298.7±26.93mm3。方差分析合并LSD post hoc法兩兩比較MB+ShRNA組與其他兩組有明顯差異(p0.01)。表明IB+ShRNA組裸鼠皮下種植瘤體積較其他兩組有明顯減小。(2)對MB+ShRNA組、MB組與NC組進(jìn)行動態(tài)觀察至成瘤后第15天,皮下種植瘤重量分別為0.63-0.09g,1.62±0.17g,1.74±0.26g。Tukey法兩兩比較,結(jié)果顯示MB+ShRNA組瘤重較其他兩組有明顯差異(p0.01),MB+ShRNA組裸鼠皮下種植瘤與其他兩組相比瘤重明顯減輕。結(jié) 論1.本實驗成功構(gòu)建人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251皮下種植瘤的裸鼠模型。2.實驗中成功利用超聲聯(lián)合微泡液輔助介導(dǎo)了慢病毒載體轉(zhuǎn)染U251人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的裸鼠皮下種植瘤模型。3.實驗結(jié)果驗證了體內(nèi)環(huán)境下超聲聯(lián)合微泡液輔助介導(dǎo)靶向HMGA2的ShRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤可以有效抑制腫瘤的生長。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4

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本文編號：1889374