本文選題：免疫監(jiān)視 + 腫瘤再生細(xì)胞�。� 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：惡性腫瘤是現(xiàn)代社會(huì)人類常見(jiàn)的死亡原因之一,研究腫瘤的生物學(xué)特性對(duì)于攻克腫瘤有著重要的意義。2011年Weinberg提出惡性了腫瘤10大特征,在原有的6個(gè)特征的基礎(chǔ)上,新增了避免免疫摧毀、促進(jìn)腫瘤相關(guān)炎癥、細(xì)胞能量代謝異常和基因組不穩(wěn)定和突變4大特征。其中避免免疫摧毀是惡性腫瘤和免疫系統(tǒng)不斷博弈的結(jié)果,也是腫瘤生物治療的核心。腫瘤和免疫系統(tǒng)的之間關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜,1970年Burnet提出了“腫瘤免疫監(jiān)視”假說(shuō),2002年Schreiber等人又在此基礎(chǔ)上不斷完善,提出了“腫瘤免疫編輯學(xué)說(shuō)”。腫瘤免疫編輯學(xué)說(shuō)更加全面準(zhǔn)確的闡述了腫瘤和免疫系統(tǒng)的相互作用,將整個(gè)腫瘤免疫監(jiān)視的過(guò)程分為3個(gè)主要階段:清除階段、平衡階段和逃逸階段。其中平衡階段是3個(gè)階段中最關(guān)鍵的部分,與后續(xù)的腫瘤復(fù)發(fā)有著直接的關(guān)系,在平衡階段,免疫系統(tǒng)有可能將腫瘤細(xì)胞限制在休眠狀態(tài)。腫瘤休眠是一個(gè)臨床概念,主要是指經(jīng)過(guò)手術(shù)治療的腫瘤患者,殘余的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)長(zhǎng)期存在而又沒(méi)有明顯生長(zhǎng)的一種狀態(tài)。腫瘤休眠是腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要組成部分,也是腫瘤復(fù)發(fā)的根本原因,因此將休眠的腫瘤細(xì)胞成為“惡魔的種子”。雖然這一概念已經(jīng)提出很長(zhǎng)時(shí)間,但是其機(jī)制卻不清楚,原因可能在于:研究模型比較匱乏,至今為止沒(méi)有很理想的腫瘤休眠模型去模擬這一臨床行為;而且由于腫瘤的異質(zhì)性的存在,使得研究必須要深入到腫瘤細(xì)胞群體的各個(gè)亞群;再者免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子更是錯(cuò)綜復(fù)雜,大大提高了研究的難度。本研究采用體外共培養(yǎng)腫瘤特異性CTL和腫瘤細(xì)胞,觀察CTL對(duì)不同亞群腫瘤細(xì)胞的作用效果,發(fā)現(xiàn)了特異性CTL不能殺傷TRCs,但是可誘導(dǎo)TRCs進(jìn)入休眠。在此基礎(chǔ)上篩選出了 IFN-γ這一細(xì)胞因子,以IFN-γ為切入點(diǎn),建立了體內(nèi)體外腫瘤休眠的模型,在一個(gè)新的層次證明了腫瘤免疫監(jiān)視的存在,具有重要的免疫學(xué)和生物學(xué)價(jià)值。本課題的研究?jī)?nèi)容主要包括三個(gè)部分:(1)IFN-γ體外誘導(dǎo)腫瘤再生細(xì)胞休眠;(2)IFN-γ體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤再生細(xì)胞休眠;(3)IFN-γ誘導(dǎo)腫瘤再生細(xì)胞休眠機(jī)制初探。目的:IFN-γ誘導(dǎo)腫瘤再生細(xì)胞休眠模型的建立及機(jī)制初探方法:取共培養(yǎng)上清(CM)、PBS培養(yǎng)TRCs,比較TRCs克隆數(shù)目、大小的變化,FCM分析CM對(duì)TRCs的殺傷以及對(duì)TRCs細(xì)胞周期的影響;利用ELISA檢測(cè)CM中各種因子的含量,使用中和抗體篩選導(dǎo)致TRCs的增殖受到影響的細(xì)胞因子;小鼠皮下接種OVA-B16黑色素瘤TRCs,FCM分析不同組瘤塊內(nèi)OVA-B16黑色素瘤TRCs細(xì)胞的細(xì)胞周期;5d、10d分別取相應(yīng)位置小鼠皮膚進(jìn)行免疫組化、HE染色,統(tǒng)計(jì)腫瘤大小;體外3D纖維蛋白軟凝膠培養(yǎng)B16 TRCs,接種至小鼠皮下,構(gòu)建小鼠荷瘤模型,待腫瘤長(zhǎng)至5 X 5mm時(shí),給予小鼠皮下注射IFN-γ,取瘤組織固定切片,WB、Confocal分析IDO1、AhR蛋白表達(dá)水平及表達(dá)變化;取腫瘤組織,將細(xì)胞進(jìn)行3D纖維蛋白軟凝膠培養(yǎng),5d后,統(tǒng)計(jì)各組克隆形成數(shù)目;聯(lián)用IFN-γ以及IDO信號(hào)通路的抑制劑,分析腫瘤組織中TRCs的比例以及細(xì)胞周期水平變化。長(zhǎng)時(shí)間聯(lián)用IFN-γ以及IDO信號(hào)通路的抑制劑(1MT/DMF)治療荷瘤小鼠,觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況以及生存期變化。結(jié)果:1.經(jīng)過(guò)CM培養(yǎng)后的TRCs在2d和4d克隆體積大小比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),且與PBS組培養(yǎng)后的TRCs相比,克隆數(shù)目比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但是CM培養(yǎng)的TRCs克隆體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于PBS組培養(yǎng)的TRCs,兩組間比價(jià)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。FCM細(xì)胞周期分析顯示,相對(duì)PBS組(G0/G1:47.21%),CM組TRCs處于G0/G1期的比例提高至77.98%,兩組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。2.ELISA 檢測(cè) CM 顯示上清中存在 IFN-γ(680.25 pg/mL)、TNF-a(170.40 pg/mL)、IL-2(15 pg/mL)、IL-10(32 pg/mL)。而使用 IFN-γ 中和抗體后,FCM分析,OT-I CTL對(duì)OVA-B16黑色素瘤細(xì)胞的殺傷明顯降低,由30.62%下降至12.88%,兩組間數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),而對(duì)OVA-B16黑色素瘤TRCs的殺傷兩組數(shù)據(jù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。FCM細(xì)胞周期分析顯示,相對(duì)CM組(G0/G1:77.65%),anti-IFN-γ 組 TRCs 處于 G0/G1 期的比例下降至 52.81%,兩組間數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。3.FCM分析顯示相對(duì)于PBS組(G0/G1:30.12%),CTL組處理后瘤塊內(nèi)OVA-B16黑色素瘤TRCs的G0/G1期上升至76.53%,兩組間數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);相對(duì)于 CTL 組(G0/G1:75.98%),anti-IFN-γ/CTL 組處理后瘤塊內(nèi)OVA-B16黑色素瘤TRCs的G0/G1期下降至51.94%,兩組間數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);相對(duì)于PBS組(G0/G1:17.20%),IFN-γ組處理后瘤塊內(nèi)B16黑色素瘤TRCs的G0/G1期上升至66.80%,兩組間數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。4.免疫組化、HE染色顯示PBS組腫瘤大小20d明顯大于5d,兩組間數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);而IFN-γ組腫瘤大小20d與5d變化不明顯,兩組間數(shù)據(jù)比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);IFN-γ組腫瘤大小10d與5d變化不明顯,兩組間數(shù)據(jù)比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),而IFN-γ/anti-IFN-γ組腫瘤大小l0d明顯大于5d,兩組間數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。5.Confocal、Western Blot 結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò) IFN-γ處理之后,Confocal、Western Blot檢測(cè)得IDO1水平明顯上調(diào),AhR明顯入核;與正常組相比,IFN-γ組的TRCs克隆形成數(shù)目無(wú)明顯變化(P0.05),聯(lián)用IFN-γ以及IDO信號(hào)通路的抑制劑(1MT、DMF)組的TRCs克隆形成數(shù)目明顯減少(P0.01);FCM分析顯示,與正常組相比,IFN-γ組細(xì)胞大多數(shù)(34%)處于G0/G1期,而聯(lián)用IFN-γ以及IDO信號(hào)通路的抑制劑(1MT、DMF)后,大多數(shù)TRCs處于sub-GO期。各組之間相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,長(zhǎng)時(shí)間聯(lián)用IFN-γ以及IDO信號(hào)通路的抑制劑(1MT/DMF)治療荷瘤小鼠,可以明顯減小腫瘤體積、延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期,各組間數(shù)據(jù)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。小結(jié):腫瘤特異性O(shè)T-ICTL可以明顯殺傷OVA-B16黑色素瘤細(xì)胞,但是總有一部分細(xì)胞不能被殺傷,而這群沒(méi)有被殺傷的細(xì)胞經(jīng)證實(shí)即為TRCs。雖然CTL不能殺傷TRCs,但是CTL可以分泌大量的IFN-γ,利用IFN-γ將TRCs誘導(dǎo)至休眠狀態(tài)。體外結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),IFN-γ的確能夠誘導(dǎo)TRCs進(jìn)入休眠狀態(tài),使得TRCs的克隆大小維持不變、細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。腫瘤特異性O(shè)T-I CTL在體內(nèi)也可以將OVA-B16黑色素瘤TRCs誘導(dǎo)至休眠,這一作用可以被anti-IFN-γ所阻斷,說(shuō)明CTL是通過(guò)INF-γ來(lái)誘導(dǎo)TRCs進(jìn)入休眠的,進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),INF-γ的確也可以誘導(dǎo)TRCs至休眠狀態(tài)。IFN-γ可以顯著上調(diào)TRCs的IDO1表達(dá),通過(guò)上調(diào)IDO1,誘導(dǎo)AhR入核使得TRCs進(jìn)入休眠狀態(tài),而聯(lián)用IFN-γ以及IDO信號(hào)通路的抑制劑(1MT/DMF)治療荷瘤小鼠,可以明顯減小腫瘤體積、延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存期。
[Abstract]:Tumor dormancy is one of the most important parts of tumor and immune system . The effects of CM on TRCs and cell cycle were analyzed by means of ELISA . The results were as follows : 1 . The volume of TRCs was increased to 77.98 % in mice . IL - 10 ( 32 pg / mL ) . Compared with the control group ( G0 / G1 : 77.65 % ) , there was no significant difference between the two groups ( P0.01 ) . Compared with the group of CTL ( G0 / G1 : 77.65 % ) , there was no significant difference between the two groups ( P0.01 ) . The results showed that IFN - 緯 could induce TRCs to enter dormant state . The results showed that IFN - 緯 could induce TRCs to enter dormant state .

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R730.3

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本文編號(hào)：1871412