本文選題：腦膠質(zhì)瘤 + 真核翻譯起始因子3亞基c　； 參考：《河北醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是最常見、難以控制和最致命的人類顱內(nèi)腫瘤,占原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%以上。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的神經(jīng)病理學分類,腦膠質(zhì)瘤被分為星形細胞瘤、少突星形細胞瘤、室管膜細胞瘤、髓母細胞瘤、多形膠質(zhì)母細胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤和脈絡叢乳頭狀瘤等。世界衛(wèi)生組織根據(jù)腦膠質(zhì)瘤的惡性程度將其分為I級、II級、III級和IV級四個級別。I級腦膠質(zhì)瘤在生物學上是良性腫瘤,完全切除能夠治愈;II級腦膠質(zhì)瘤屬于低度惡性,可能經(jīng)歷較長的臨床過程,但早期彌漫浸潤到臨近的腦組織中導致即使手術也會因術后復發(fā)而不能治愈;III級腦膠質(zhì)瘤比II級膠質(zhì)瘤呈現(xiàn)出更多的間變和惡性增殖的特征,常常進展快而致命;IV級腦膠質(zhì)瘤性質(zhì)更加惡劣,他們對化療和放療都不敏感,往往生存時間更短。程度最高的星形細胞瘤被稱為多形膠質(zhì)母細胞瘤或簡稱為GMB,屬于腦膠質(zhì)瘤IV級。在成年人,惡腦腦膠質(zhì)瘤(III級和IV級)占所有原發(fā)性腦腫瘤的比例接近60%。惡性腦膠質(zhì)瘤,尤其多形膠質(zhì)母細胞瘤,對化療和放療反應差、術后復發(fā)率高,是最難治療的腫瘤。盡管近年來顯微手術、放療和化療等治療措施獲得較大進展,但惡性腦膠質(zhì)瘤患者平均生存時間仍然是9~12個月,很少病人能獲得治愈。據(jù)報道,除了屬于I級的毛細胞型星形細胞瘤之外,罹患其它類型腦膠質(zhì)瘤病人自診斷后5年生存率不足3%。腦膠質(zhì)瘤病人的預后仍然非常差,近些年也沒有明顯的變化。而且,有報道老年病人比年輕成年病人的相對風險高出3.18倍。無論是低級別還是高級別,腦膠質(zhì)瘤均呈現(xiàn)浸潤性生長和富有血管的特性。腫瘤細胞浸潤臨近的腦組織,常常導致常規(guī)治療手段的失敗。如今,許多化療藥物被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生較為嚴重的副作用,因此也影響腫瘤治療的效果。大約有30%的病人由于現(xiàn)代藥物嚴重的副作用而放棄化療。為此,人們已經(jīng)進行了很多努力和嘗試,通過開展新的治療方法和發(fā)現(xiàn)新的藥物作用機制來提高藥物的治療效果,減少藥物的毒副作用。目前,盡管一些藥物用于腦膠質(zhì)瘤的臨床治療,但存在著我們?nèi)绾翁岣咧委熜Чp少并發(fā)癥和降低復發(fā)率等許多挑戰(zhàn)。分子遺傳學研究人員已經(jīng)證實基因變化參與了惡性腫瘤的發(fā)生和進展,包括雜合子10(LOH10)、磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)、腫瘤蛋白p53(TP53)、表皮生長因子(EGFR)和p16的丟失等等。人們認為腫瘤的發(fā)生和進展同多種基因改變和基因表達模式改變的累積有關。掌握腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和進展基因改變的分子通路,將有希望在不遠的將來獲得新的有效的治療靶點,這將有助于提高腦膠質(zhì)瘤患者的生存狀況,并改善他們的醫(yī)療預后。蛋白質(zhì)翻譯異常在人類腫瘤中廣泛存在。近年來,人們發(fā)現(xiàn)真核翻譯起始因子(e IFs)在多種人類腫瘤發(fā)生和進展中發(fā)揮著重要作用。然而,真核翻譯起始因子在腦膠質(zhì)瘤中的作用和機制仍然不清楚,還需要進一步研究闡明。本研究探討了真核翻譯起始因子3(e IF3)的核心亞基e IF3c在人腦膠質(zhì)瘤中的作用。首先,采用免疫組織化學SP技術和RT-PCR技術檢測了e IF3c在人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達。然后,利用慢病毒介導si RNA的方法,在體外實驗中探討了e IF3c基因沉默對U87 MG細胞的增殖、凋亡、細胞周期和克隆形成等的影響。隨后,又建立了膠質(zhì)瘤裸鼠移植模型,在體內(nèi)實驗中觀察了e IF3c基因沉默對腦膠質(zhì)瘤形成和增殖生長的影響。根據(jù)以上的實驗結果,證實了e IF3c在腦膠質(zhì)瘤的形成和進展中起著重要作用,以期在臨床實踐中為腦膠質(zhì)瘤的基因治療奠定極為重要的理論基礎。本課題研究內(nèi)容包括以下三部分:第一部分EIF3C在人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的表達研究目的:采用免疫組織化學SP方法和逆轉錄聚合酶鏈式反應技術,檢測e IF3c在人腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織標本中的表達情況,探討e IF3c在腦膠質(zhì)瘤中的表達與腦膠質(zhì)瘤的病理級別、腫瘤大小、位置、病人年齡和性別等臨床特性的相關性。方法：1病人的臨床資料和腫瘤標本的處置腦膠質(zhì)瘤標本來自河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)外科2008年1月-2013年12月期間接收外科手術的83例腦膠質(zhì)瘤患者。另外對照組27例正常腦組織標本來自同期27例顱腦損傷行內(nèi)減壓手術的患者。所有標本均經(jīng)兩名以上神經(jīng)病理醫(yī)師明確診斷。所有患者術前均未接受放療、化療和免疫治療。83例腦膠質(zhì)瘤患者中,男性44例,女性39例,平均年齡為44.54±12.53歲(年齡范圍16歲到73歲)。所有組織標本取材后均分為兩部分:一部分標本速凍并儲存在-80℃液氮中以備抽取目的基因e IF3c的m RNA;另一部分標本經(jīng)10%福爾馬林固定,石蠟包埋,應用免疫組織化學SP法檢測e IF3c的表達。詳細記錄所有標本的病人年齡、性別、腫瘤大小、生長部位和病理級別等臨床資料。在液氮中保存的標本中,取其中的31例腦膠質(zhì)瘤標本和5例正常腦組織標本進行RT-PCR實驗,用于檢測內(nèi)源基因e IF3c的表達。2采用IHC方法檢測腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中e IF3c蛋白的表達腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織標本中e IF3c蛋白的表達采用免疫組化染色進行檢測。將石蠟塊切成4μm厚度放在玻璃載片上。二甲苯脫蠟,切片在乙醇梯度溶液下復水;將切片浸入0.01mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中,抗原微波修復30分鐘,切片10%牛血清蛋白封閉,滴加兔抗人單克隆抗體e IF3c抗體孵化過夜,滴加抗山羊二抗60分鐘,之后切片DAB顯色,蘇木素復染。在顯微鏡下獲取數(shù)字圖像。3 e IF3c蛋白的表達同臨床特征之間的關系分析分析e IF3c蛋白的表達同腦膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別以及腫瘤病理級別、大小、位置的關系。4 Real-time PCR檢測腦膠質(zhì)瘤及正常腦組織中e IF3c的表達提取液氮保存的31例腦膠質(zhì)瘤組織及5例正常腦組織標本中的總RNA,并反轉錄成c DNA,采用real-time PCR方法檢測內(nèi)源基因e IF3c的表達情況。數(shù)據(jù)應用Graph Pad Prism 4.0軟件進行分析,并應用2-ΔΔCT法測定基因表達的相對量。結果：1 e IF3c蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中過度表達e IF3c蛋白主要定位于細胞質(zhì),高倍鏡下在細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆�；驈浡S色者為陽性細胞。83腦膠質(zhì)瘤標本中,e IF3c蛋白呈陽性表達有69例,呈陰性表達為14例,陽性表達率為83.13%(69/83)。而在27例正常腦組織中e IF3c蛋白僅1例呈微弱表達,其余26例呈陰性表達,陽性表達率僅為3.7%(1/27)。e IF3c蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達陽性率明顯高于正常腦組織(χ2=57.02,P0.0001)。e IF3c蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中存在過度表達。2 e IF3c蛋白在腦膠質(zhì)瘤中的表達與臨床特征之間的關系e IF3c蛋白在高級別腦膠質(zhì)瘤(WHO III級和WHO IV級)中的表達陽性率為91.07%(51/56),而低級別腦膠質(zhì)瘤(WHO I級和WHO II級)表達陽性率為66.67%(18/27),兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=6.0950,P=0.01360.05);而e IF3c蛋白在腦膠質(zhì)瘤中表達的陽性率與患者的年齡、性別及腫瘤生長的部位、大小均無統(tǒng)計學意義(均P0.05)。結果表明e IF3c陽性表達率同腦膠質(zhì)瘤的級別相關。3 e IF3c基因m RNA在腦膠質(zhì)瘤中存在高表達采用real-time PCR方法,檢測液氮保存的31例腦膠質(zhì)瘤標本和5例正常腦組織標本中e IF3c基因m RNA的表達水平。結果顯示e IF3c基因m RNA在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達水平明顯高于在正常腦組織中的表達水平(P0.01)。但是,e IF3c基因m RNA表達水平同腦膠質(zhì)瘤的病理級別無關(P0.05)。4腦膠質(zhì)瘤和正常腦組織中e IF3c基因調(diào)節(jié)的倍數(shù)變化31個腦膠質(zhì)瘤樣本中有30個樣本相比正常腦組織樣本中的e IF3c基因表達上調(diào),上調(diào)倍數(shù)平均值為2.6倍�？梢赃x擇該基因e IF3c開展genecard實驗。結論：1 e IF3c蛋白在人腦膠質(zhì)瘤中過度表達。2 e IF3c高表達和腦膠質(zhì)瘤的惡性表型有關,而與患者年齡、性別和膠質(zhì)瘤生長部位和大小無關。3 e IF3c m RNA在腦膠質(zhì)瘤中存在過度表達,但同腦膠質(zhì)瘤的病理級別無關。4 e IF3c基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達上調(diào)。第二部分EIF3C對腦膠質(zhì)瘤U87 MG細胞增殖作用的體外研究目的:利用RNA干擾技術進行一系列細胞學功能實驗,探討e IF3c基因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤U87MG細胞的增殖、凋亡、細胞周期和克隆形成的影響,明確e IF3c在人腦膠質(zhì)瘤形成和進展中的作用。方法：1腦膠質(zhì)瘤細胞株培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細胞株(U87、U251、A172、U373)購自上海國家實驗細胞資源共享平臺,細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)液中含有2左旋谷氨酰胺、青霉素(100 units/ml)和鏈霉素(100μg/ml),所有細胞株均在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。2半定量RT-PCR檢測e IF3c在腦膠質(zhì)瘤細胞株中的表達從四種腦膠質(zhì)瘤細胞株(U87、U251、A172、U373)中抽提總RNA,采用半定量RT-PCR方法檢測e IF3c基因m RNA表達水平,確認e IF3c在腦膠質(zhì)瘤細胞株中存在表達。3 e IF3c RNA干擾慢病毒載體的構建和轉染e IF3c-si RNA序列為5’-GACCATCCGTAATGCCATGAA-3’,scrambled si RNA序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。這些核苷酸序列合成并通過表達si RNA的載體p GCSIL-GFP和包裝e IF3c-si RNA的慢病毒插入質(zhì)粒。建立穩(wěn)定轉染慢病毒的U87 MG和237T細胞系。4 q PCR檢測m RNA水平e IF3c敲減效率U87細胞按照組別感染慢病毒表達質(zhì)粒。感染3天后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達情況,感染5天后收集細胞。然后,采用RT-PCR方法檢測e IF3c的m RNA敲減效率。5蛋白質(zhì)印跡分析為離析蛋白質(zhì),細胞用RIPA緩沖液收集。應用SDS-PAGE將蛋白分離,再將蛋白轉移到PVDF膜上,用一抗、二抗孵育,采用ECL試劑盒進行檢測。X線顯影獲得顯示條帶的膠片。6采用Brd U方法測定U87MG細胞增殖實驗增殖細胞的DNA合成用Brd U方法進行測定。U87 MG細胞轉染表達e IF3c-si RNA或scr-si RNA的慢病毒,培養(yǎng)48小時,懸浮并以合適的濃度在96孔板上接種,5%CO2、37?C的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4天。加入稀釋的溴脫氧尿苷(Brd U)后的第1天和第4天收集細胞,用酶標儀在450nm波長下測定其吸光度(OD),Brd U信號和細胞增殖根據(jù)吸光值進行分析。7細胞周期檢測U87MG細胞轉染表達e IF3c-si RNA或scr-si RNA的慢病毒,在37℃條件下培養(yǎng)96小時。細胞重懸,接種在6cm的培養(yǎng)盤中。細胞長到80%方法:融合率時被收集固定,PBS洗滌,含有PI、RNase、PBS進行染色。最后,應用流式細胞技術測定細胞周期。8細胞克隆形成實驗U87MG細胞轉染表達e IF3c-si RNA或scr-si RNA的慢病毒,培養(yǎng)5天后收集、懸浮并種植在6孔培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)2周后,細胞用4%多聚甲醛固定,稀釋的Giemsa染料染色20分鐘,蒸餾水漂洗干凈,在熒光顯微鏡下計數(shù)超過50個細胞的克隆。9細胞凋亡實驗使用Annexin V-APC染色、流式細胞儀檢測細胞凋亡。U87MG細胞轉染表達e IF3c-si RNA或scr-si RNA的慢病毒,培養(yǎng)5天,收集并用PBS洗滌,用含有5μl Annexin V-APC的緩沖液重懸細胞沉淀,室溫避光10-15分鐘。使用流式細胞儀檢測細胞。結果：1 e IF3c在腦膠質(zhì)瘤細胞株中的表達半定量RT-PCR檢測膠質(zhì)瘤細胞株U87、U251、A172、U373結果顯示,e IF3c基因的m RNA在4種腦膠質(zhì)瘤細胞株中均存在表達。2構建表達e IF3c-si RNA或scrambled si RNA的慢病毒載體成功構建了表達e IF3c-si RNA或scrambled si RNA的慢病毒載體,并實現(xiàn)其在U87MG細胞的穩(wěn)定高表達。3慢病毒介導的si RNA能有效抑制膠質(zhì)瘤細胞系e IF3c基因的表達應用熒光定量PCR方法檢測e IF3c m RNA水平。沉默e IF3c基因?qū)е耬 IF3c m RNA表達下降95%。結果表明利用慢病毒介導的RNAi技術能夠高效敲減e IF3c基因在m RNA水平的表達。4沉默e IF3c基因后293T細胞e IF3c蛋白水平明顯降低蛋白水平用免疫印跡方法檢測。同陰性對照組相比,應用RNA干擾技術e IF3c基因沉默后,293T細胞的e IF3c蛋白明顯下降。GAPDH作為內(nèi)參對照。5敲減e IF3c能有效抑制U87MG細胞的增殖細胞計數(shù)結果顯示感染24小時后,e IF3c-si RNA組U87MG細胞增殖明顯受到抑制,之后4天e IF3c敲減對U87MG細胞增殖的抑制作用更加明顯。Brd U法檢測結果顯示e IF3c-RNAi組U87MG細胞Brd U值明顯減少,e IF3c-RNAi組和Scr-RNAi組比較具有顯著性差異(P0.05)。結果表明敲減e IF3c基因表達能顯著抑制U87MG細胞的增殖。6敲減e IF3c基因表達抑制U87MG細胞克隆形成克隆形成試驗顯示Scr-si RNA對照組U87MG細胞形成克隆數(shù)目平均為23個,而e IF3c-si RNA實驗組僅為15個,相比減少34.8%,他們之間有顯著性差異(P0.05)。結果提示e IF3c基因與U87MG細胞的克隆形成能力密切相關。7 e IF3c敲減導致U87MG細胞周期停止細胞周期分布顯示,e IF3c敲減顯著導致U87MG細胞在G0/G1期停止,在S期細胞比例相應減少。e IF3c-si RNA組在G0/G1期的細胞比例增加了71.42%和79.05%,而在S期的比例下降了17.09%和7.83%。e IF3c-si RNA組和Scr-si RNA組比較有顯著性差異(P0.05)。因此,敲減e IF3c基因表達抑制了從G1期到S期的過渡。8 e IF3c敲減促進U87MG細胞凋亡利用Annexin V-APC檢測細胞凋亡顯示實驗組e IF3c-si RNA U87MG細胞凋亡率為5.83%,而對照組Scr-si RNA U87MG細胞凋亡率只有2.78%,兩者比較有顯著性差異(P0.01)。結果表明e IF3c基因敲減可能誘導U87MG細胞凋亡。結論：1采用半定量PCR技術,e IF3c基因在腦膠質(zhì)瘤細胞株(U87、U251、A172、U373)中存在表達。2通過RNAi技術,下調(diào)慢病毒介導的U87MG細胞中的e IF3c基因表達水平,能顯著抑制U87MG細胞的增殖,促進他們的凋亡。3 e IF3c基因表達敲減誘導U87MG細胞G0/G1期阻止,抑制G1到S期的轉換。e IF3c基因調(diào)控細胞周期分布的作用可能是影響U87MG細胞增殖和凋亡的機制之一。4下調(diào)e IF3c基因的表達可以明顯抑制U87MG細胞的增殖,e IF3c基因可以作為腦膠質(zhì)瘤治療新的靶點。第三部分EIF3C對腦膠質(zhì)瘤U87MG細胞增殖作用的體內(nèi)研究目的:建立人腦膠質(zhì)瘤細胞系U87MG裸小鼠皮下荷瘤模型,并對其生物學特性進行研究,進一步驗證體外實驗發(fā)現(xiàn)的結果。方法：1實驗動物分組無胸腺裸鼠共24只,隨機分為Negative control、Scrambled和e IF3c-si RNA三組,并分別處理。2人腦膠質(zhì)瘤U87MG細胞培養(yǎng)U87MG細胞體外培養(yǎng)并制備細胞懸液。3腦膠質(zhì)瘤裸鼠荷瘤移植模型的建立無胸腺裸鼠皮下注射處理過或沒有處理過的U87MG細胞。Negative control組小鼠皮下注射沒有感染的U87MG細胞;Scramble組小鼠注scrambled si RNA U87MG細胞;e IF3c-si RNA組小鼠注射e IF3c-si RNA U87MG細胞。4腫瘤體積和重量的測定從裸鼠注射U87MG細胞第10天開始,腫瘤的直徑每隔一天記錄一次,共18天。裸鼠喂養(yǎng)28天觀察期結束,將其處死,切除皮下腫瘤制作標本,分別稱重。結果：1腦膠質(zhì)瘤裸鼠移植模型建立腦膠質(zhì)瘤U87MG裸鼠移植模型成功建立,并進行體內(nèi)實驗。2體內(nèi)實驗e IF3c敲減能抑制腫瘤的生長在最初的11天里,三組之間腫瘤體積測量無顯著差異。然而在第13天后,e IF3c-si RNA組腫瘤生長明顯受到抑制。觀察期結束,e IF3c-si RNA組腫瘤平均體積比Scr-si RNA組和Control組明顯減少(P0.01)。3體內(nèi)實驗e IF3c敲減能減少腫瘤的重量觀察期結束,裸鼠處死,瘤體從裸鼠皮下切除并稱重,e IF3c-si RNA組瘤體的重量比Scr-si RNA組和Control組也顯著降低(P0.01)。結論：1在體內(nèi)實驗e IF3c敲減能顯著抑制U87 MG細胞增殖和腫瘤增長。2 e IF3c基因可以作為人類腦膠質(zhì)瘤新的治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.4

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本文編號：1869337