本文選題：膠質肉瘤 + 膠質瘤干細胞��； 參考：《福建醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：目的:1.通過體外篩選獲得針對腦膠質肉瘤細胞特異性的、高親和力的核酸適配體,用于識別膠質肉瘤細胞和臨床腦膠質肉瘤病理組織。2.通過體外篩選獲得針對腦膠質瘤干細胞特異性的、高親和力的核酸適配體,作為一種新的分子探針用于膠質瘤干細胞的鑒定和分選。方法:1.通過化學合成一個隨機寡核苷酸文庫,包含分別為18個堿基的前、后引物區(qū),以及含45個堿基的隨機核苷酸區(qū)。采用Cell-SELEX(配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化)技術,以取自臨床腦膠質肉瘤的病理組織,經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代而獲得的細胞系k308作為靶細胞,以正常腦星形膠質細胞SVGp12作為對照細胞,經(jīng)過施加不同的篩選條件,使DNA文庫不斷富集;隨后將富集的DNA文庫進行PCR擴增、克隆測序,得到候選的核酸適配體并進一步表征。以測定平衡解離常數(shù)K_d值來評估核酸適配體的親和力;選取膠質瘤細胞U251、U87、T98G以及來源于乳腺、結腸、肝、宮頸、肺的癌細胞以流式細胞術分析核酸適配體的選擇性。另外分別選取臨床腦膠質肉瘤病理組織切片以及其它器官來源的腫瘤組織切片,用激光共聚焦顯微鏡組織成像技術檢測核酸適配體的識別能力。2.合成一個序列長度為80個堿基的隨機寡核苷酸文庫:5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-40N-AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’。以膠質瘤干細胞為正篩細胞,經(jīng)CD133磁珠分選,免疫細胞化學染色及Western-Blot、RT-PCR等方法鑒定;以膠質瘤細胞U87作為反篩細胞,采用Cell-SELEX技術,得到候選的核酸適配體并進一步表征。測定其平衡解離常數(shù)K_d值,用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測核酸適配體的識別能力。選擇U251、T98G、k308、Hu H-7、Hela、SW480、MDA-MB-231以及膠質瘤干細胞經(jīng)分化后的細胞,以流式細胞術分析核酸適配體的選擇性。用胰酶消化方式來考察核酸適配體靶標性質。通過同CD133蛋白、CD133抗體結合及競爭實驗進一步考察核酸適配體實際應用。結果:1.經(jīng)過16個循環(huán)的篩選,最終獲得5條特異靶向膠質肉瘤細胞的核酸適配體。這些核酸適配體K_d值介于10-100 nmol/L,流式細胞術及激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)他們可以特異性地結合膠質肉瘤細胞,將其中親和力和特異性最佳的核酸適配體WQY-9序列進一步優(yōu)化,得到序列長度為63個堿基的核酸適配體WQY-9-B,測定其K_d值為23±5 n M,能夠在4℃和37℃條件下識別膠質肉瘤細胞,而不與U251、U87、T98G及其他組織來源的癌細胞發(fā)生結合。經(jīng)胰蛋白酶消化處理后的膠質肉瘤細胞k308,核酸適配體WQY-9-B不能再與之結合;同時用WQY-9-B檢測臨床膠質肉瘤病理組織切片的陽性率為73.3%,對來源于其他器官的腫瘤組織幾乎不結合。2.膠質瘤干細胞具有成球生長、多向分化、裸鼠移植成瘤的干細胞特性。經(jīng)過20個循環(huán)的篩選,最終獲得5條特異靶向膠質瘤干細胞的核酸適配體。其中核酸適配體W5的親和力和特異性均最佳,K_d值為4.9±1.4 n M,選擇W5進行序列截短優(yōu)化,得到序列長度為66個堿基的核酸適配體W5-7,測定K_d值為4.4±1.1 n M。流式細胞術及激光共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)W5-7在4℃和37℃時具有同樣識別膠質瘤干細胞的能力。與經(jīng)過胰蛋白酶預先處理后的膠質瘤干細胞孵育,W5-7喪失原有的結合力;同時W5-7能夠識別CD133陽性表達的膠質瘤干細胞,但不結合CD133蛋白,與CD133抗體在膠質瘤干細胞上的結合不存在競爭關系。結論:1.所得到膠質肉瘤的核酸適配體WQY-9及WQY-9-B具有特異性以及高親和力;可以用于區(qū)分膠質肉瘤與膠質瘤細胞;核酸適配體WQY-9-B的靶標可能為膠質肉瘤細胞表面的某種膜蛋白;WQY-9-B具有針對臨床膠質肉瘤病理組織優(yōu)良的識別能力,可以作為膠質肉瘤的一種分子探針,將在膠質肉瘤的早期診斷、靶向遞藥、改善預后等方面發(fā)揮重要作用。2.所得到膠質瘤干細胞的核酸適配體W5及W5-7具有高親和力和特異性;可以區(qū)分膠質瘤干細胞和膠質瘤細胞及其他組織來源的腫瘤細胞;W5-7可以對膠質瘤干細胞進行成像;W5-7的靶標可能為膠質瘤干細胞表面的某種膜蛋白;W5-7可以替代CD133抗體來鑒定和分選膠質瘤干細胞,并用以甄定出膠質瘤干細胞的特異性標記物;將對實現(xiàn)從膠質瘤源頭上的精準診療,提高膠質瘤的整體療效等方面具有重要的臨床意義。
[Abstract]:Objective : 1 . To obtain a nucleic acid aptamer with high affinity for glioma stem cells and to identify the affinity of nucleic acid aptamer by using cell - SELEX ( ligand index enrichment system evolution ) . Human glioma stem cells ( WQY - 9 - B ) were screened by trypsinization . The results were as follows : 1 . The results were as follows : 1 . The affinity and specificity of CD133 protein and CD133 antibody could not be combined with those of U251 , U87 , T98G and other tissues . It has important clinical significance to realize accurate diagnosis and treatment from the source of glioma and improve the overall curative effect of glioma .

【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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