本文選題：膠質(zhì)肉瘤 + 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞��； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:1.通過體外篩選獲得針對(duì)腦膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞特異性的、高親和力的核酸適配體,用于識(shí)別膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞和臨床腦膠質(zhì)肉瘤病理組織。2.通過體外篩選獲得針對(duì)腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞特異性的、高親和力的核酸適配體,作為一種新的分子探針用于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的鑒定和分選。方法:1.通過化學(xué)合成一個(gè)隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù),包含分別為18個(gè)堿基的前、后引物區(qū),以及含45個(gè)堿基的隨機(jī)核苷酸區(qū)。采用Cell-SELEX(配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化)技術(shù),以取自臨床腦膠質(zhì)肉瘤的病理組織,經(jīng)原代培養(yǎng)、傳代而獲得的細(xì)胞系k308作為靶細(xì)胞,以正常腦星形膠質(zhì)細(xì)胞SVGp12作為對(duì)照細(xì)胞,經(jīng)過施加不同的篩選條件,使DNA文庫(kù)不斷富集;隨后將富集的DNA文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序,得到候選的核酸適配體并進(jìn)一步表征。以測(cè)定平衡解離常數(shù)K_d值來評(píng)估核酸適配體的親和力;選取膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、U87、T98G以及來源于乳腺、結(jié)腸、肝、宮頸、肺的癌細(xì)胞以流式細(xì)胞術(shù)分析核酸適配體的選擇性。另外分別選取臨床腦膠質(zhì)肉瘤病理組織切片以及其它器官來源的腫瘤組織切片,用激光共聚焦顯微鏡組織成像技術(shù)檢測(cè)核酸適配體的識(shí)別能力。2.合成一個(gè)序列長(zhǎng)度為80個(gè)堿基的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù):5’-ATA CCA GCT TAT TCA ATT-40N-AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3’。以膠質(zhì)瘤干細(xì)胞為正篩細(xì)胞,經(jīng)CD133磁珠分選,免疫細(xì)胞化學(xué)染色及Western-Blot、RT-PCR等方法鑒定;以膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87作為反篩細(xì)胞,采用Cell-SELEX技術(shù),得到候選的核酸適配體并進(jìn)一步表征。測(cè)定其平衡解離常數(shù)K_d值,用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)核酸適配體的識(shí)別能力。選擇U251、T98G、k308、Hu H-7、Hela、SW480、MDA-MB-231以及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞經(jīng)分化后的細(xì)胞,以流式細(xì)胞術(shù)分析核酸適配體的選擇性。用胰酶消化方式來考察核酸適配體靶標(biāo)性質(zhì)。通過同CD133蛋白、CD133抗體結(jié)合及競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察核酸適配體實(shí)際應(yīng)用。結(jié)果:1.經(jīng)過16個(gè)循環(huán)的篩選,最終獲得5條特異靶向膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞的核酸適配體。這些核酸適配體K_d值介于10-100 nmol/L,流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)他們可以特異性地結(jié)合膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞,將其中親和力和特異性最佳的核酸適配體WQY-9序列進(jìn)一步優(yōu)化,得到序列長(zhǎng)度為63個(gè)堿基的核酸適配體WQY-9-B,測(cè)定其K_d值為23±5 n M,能夠在4℃和37℃條件下識(shí)別膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞,而不與U251、U87、T98G及其他組織來源的癌細(xì)胞發(fā)生結(jié)合。經(jīng)胰蛋白酶消化處理后的膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞k308,核酸適配體WQY-9-B不能再與之結(jié)合;同時(shí)用WQY-9-B檢測(cè)臨床膠質(zhì)肉瘤病理組織切片的陽(yáng)性率為73.3%,對(duì)來源于其他器官的腫瘤組織幾乎不結(jié)合。2.膠質(zhì)瘤干細(xì)胞具有成球生長(zhǎng)、多向分化、裸鼠移植成瘤的干細(xì)胞特性。經(jīng)過20個(gè)循環(huán)的篩選,最終獲得5條特異靶向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的核酸適配體。其中核酸適配體W5的親和力和特異性均最佳,K_d值為4.9±1.4 n M,選擇W5進(jìn)行序列截短優(yōu)化,得到序列長(zhǎng)度為66個(gè)堿基的核酸適配體W5-7,測(cè)定K_d值為4.4±1.1 n M。流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)W5-7在4℃和37℃時(shí)具有同樣識(shí)別膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的能力。與經(jīng)過胰蛋白酶預(yù)先處理后的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞孵育,W5-7喪失原有的結(jié)合力;同時(shí)W5-7能夠識(shí)別CD133陽(yáng)性表達(dá)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,但不結(jié)合CD133蛋白,與CD133抗體在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞上的結(jié)合不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。結(jié)論:1.所得到膠質(zhì)肉瘤的核酸適配體WQY-9及WQY-9-B具有特異性以及高親和力;可以用于區(qū)分膠質(zhì)肉瘤與膠質(zhì)瘤細(xì)胞;核酸適配體WQY-9-B的靶標(biāo)可能為膠質(zhì)肉瘤細(xì)胞表面的某種膜蛋白;WQY-9-B具有針對(duì)臨床膠質(zhì)肉瘤病理組織優(yōu)良的識(shí)別能力,可以作為膠質(zhì)肉瘤的一種分子探針,將在膠質(zhì)肉瘤的早期診斷、靶向遞藥、改善預(yù)后等方面發(fā)揮重要作用。2.所得到膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的核酸適配體W5及W5-7具有高親和力和特異性;可以區(qū)分膠質(zhì)瘤干細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其他組織來源的腫瘤細(xì)胞;W5-7可以對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞進(jìn)行成像;W5-7的靶標(biāo)可能為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞表面的某種膜蛋白;W5-7可以替代CD133抗體來鑒定和分選膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,并用以甄定出膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物;將對(duì)實(shí)現(xiàn)從膠質(zhì)瘤源頭上的精準(zhǔn)診療,提高膠質(zhì)瘤的整體療效等方面具有重要的臨床意義。
[Abstract]:Objective : 1 . To obtain a nucleic acid aptamer with high affinity for glioma stem cells and to identify the affinity of nucleic acid aptamer by using cell - SELEX ( ligand index enrichment system evolution ) . Human glioma stem cells ( WQY - 9 - B ) were screened by trypsinization . The results were as follows : 1 . The results were as follows : 1 . The affinity and specificity of CD133 protein and CD133 antibody could not be combined with those of U251 , U87 , T98G and other tissues . It has important clinical significance to realize accurate diagnosis and treatment from the source of glioma and improve the overall curative effect of glioma .

【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 梁紅茹;楊松濤;張濤;胡桂秋;夏咸柱;;核酸適配體及其在病原微生物學(xué)中的應(yīng)用[J];生物工程學(xué)報(bào);2011年05期

2 姚遠(yuǎn);張波;;核酸適配體及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2014年08期

3 甘龍杰;蘭小鵬;;適配體芯片技術(shù)及其應(yīng)用[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2009年06期

4 蘭小鵬;;適配體技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究中的作用[J];臨床檢驗(yàn)雜志;2012年10期

5 李曉佩;楊良嶸;黃昆;李文松;孫西同;劉會(huì)洲;;核酸適配體在生化分離及檢測(cè)領(lǐng)域中的研究進(jìn)展[J];化工學(xué)報(bào);2013年01期

6 劉婷先;張娜;;適配體在腫瘤治療方面的應(yīng)用[J];生命的化學(xué);2013年05期

7 唐德平;張宇潔;毛愛紅;;適配體在體外細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用[J];重慶醫(yī)學(xué);2014年13期

8 李紅玉;閻輝;;適配體與病毒性感染診斷及治療[J];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2013年05期

9 滿燕;呂雪飛;彭廣;宋達(dá);慶宏;;雙適配體夾心微陣列芯片在凝血酶檢測(cè)中的應(yīng)用[J];生命科學(xué)儀器;2014年Z1期

10 胡燕;楊先達(dá);;核酸適配體在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2012年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 蔡圣;劉彩云;盧建忠;;基于核酸適配體和酶循環(huán)放大的腺苷化學(xué)發(fā)光檢測(cè)[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第十屆全國(guó)發(fā)光分析學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2011年

2 陳巍;趙新穎;屈鋒;;毛細(xì)管電泳法篩選蛋白質(zhì)的核酸適配體的初步研究[A];全國(guó)生物醫(yī)藥色譜學(xué)術(shù)交流會(huì)（2010景德鎮(zhèn)）論文集[C];2010年

3 楊曉娟;邴濤;梅宏成;上官棣華;;核酸適配體用于手性拆分L型和D型色氨酸[A];全國(guó)生物醫(yī)藥色譜學(xué)術(shù)交流會(huì)（2010景德鎮(zhèn)）論文集[C];2010年

4 鄭冬梅;婁新徽;;一種基于結(jié)構(gòu)開關(guān)型適配體的無標(biāo)記熒光傳感法[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第9分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2012年

5 薛利云;周小明;邢達(dá);;基于核酸適配體探針和酶輔助熒光信號(hào)擴(kuò)增的等溫高靈敏度蛋白檢測(cè)方法[A];中國(guó)光學(xué)學(xué)會(huì)2011年學(xué)術(shù)大會(huì)摘要集[C];2011年

6 馬文韜;古力;屈鋒;;毛細(xì)管電泳篩選大腸桿菌適配體的初步研究[A];全國(guó)生物醫(yī)藥色譜學(xué)術(shù)交流會(huì)（2010景德鎮(zhèn)）論文集[C];2010年

7 梁好均;徐華國(guó);鄧偉;;核酸適配體鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)變的研究[A];2014年兩岸三地高分子液晶態(tài)與超分子有序結(jié)構(gòu)學(xué)術(shù)研討會(huì)摘要集[C];2014年

8 王曉芳;程琳;耿霞;趙強(qiáng);;基于適配體修飾的磁珠和量子點(diǎn)熒光法檢測(cè)凝血酶[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第9分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2012年

9 汪海林;章大鵬;;單核苷水平核酸適配體與蛋白質(zhì)相互作用分析[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第28屆學(xué)術(shù)年會(huì)第9分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2012年

10 溫桂清;范燕燕;梁愛惠;蔣治良;;核酸適配體納米金共振散射光譜檢測(cè)血清中鉀離子[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第十五屆全國(guó)有機(jī)分析及生物分析學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 潘文;核酸適配體在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2010年

2 于洋　田野;蛋白質(zhì)檢測(cè)有了新方法[N];吉林日?qǐng)?bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 黃玉坤;基于核酸適配體識(shí)別-時(shí)間分辨熒光納米探針的生物毒素檢測(cè)方法研究[D];江南大學(xué);2015年

2 陳霞;功能核酸的篩選及在分析檢測(cè)中的應(yīng)用[D];武漢大學(xué);2012年

3 林雪霞;微流控芯片與可控適配體技術(shù)用于細(xì)胞代謝物分析及其相互作用的研究[D];北京化工大學(xué);2015年

4 周慶同;生物相空間中的適配體和藥物虛擬篩選[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

5 郭業(yè)民;基于適配體傳感器的牛奶中抗生素殘留快速檢測(cè)技術(shù)研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 李菁菁;適配體功能化的熒光納米探針用于蛋白和細(xì)胞傳感研究[D];南京大學(xué);2012年

7 于鴿;乙丙肝病毒相互干擾及適配體在肝癌診斷及靶向治療中的作用[D];吉林大學(xué);2016年

8 王成全;基于磁控適配體傳感體系的農(nóng)產(chǎn)品中典型霉菌毒素檢測(cè)研究[D];江蘇大學(xué);2016年

9 姜紅巖;自組裝RNA適配體納米傳感器[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2016年

10 胡波;海洋聚醚類毒素基于適配體的檢測(cè)及生物合成的探索[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張?jiān)聜b;蛋白質(zhì)寡核苷酸適配體的篩選與應(yīng)用研究[D];山東師范大學(xué);2009年

2 李慧玲;BHL DNA適配體對(duì)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

3 劉金釧;適配體納米金比色法靈敏度影響因素研究及其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

4 于連元;核酸適配體修飾的納米顆粒在腫瘤靶向免疫治療及靶向熱療中的應(yīng)用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

5 趙變軍;基于適配體特異性作用的乳腺癌細(xì)胞表面多種腫瘤標(biāo)記物同時(shí)檢測(cè)的新方法研究[D];南京師范大學(xué);2015年

6 喬醴峰;基于核酸適配體的β-葡萄糖醛酸苷酶一步純化固定化研究及其應(yīng)用[D];石河子大學(xué);2015年

7 呂莉;基于適配體的酶聯(lián)吸光度法檢測(cè)血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB[D];山西大學(xué);2015年

8 陳艷霞;核酸適配體/小檗堿熒光體系的構(gòu)筑及分析應(yīng)用[D];山西大學(xué);2015年

9 呂琴;基于熒光標(biāo)記適配體的熒光各向異性法檢測(cè)小分子[D];山西大學(xué);2015年

10 朱志玲;基于核酸適配體的赭曲霉毒素A SPR檢測(cè)技術(shù)研究[D];北京化工大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1859458