本文選題：自噬 + ART1��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：研究背景及目的：隨著我國居民飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣改變等因素的影響,大腸癌的發(fā)病率已呈明顯上升趨勢,但大腸癌的治療效果卻不佳。自噬水平的升高可以提高大腸癌對腫瘤藥物的抵御能力,幫助大腸癌細(xì)胞的繼續(xù)生長。自噬對大腸癌的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用。因此,探索大腸癌中調(diào)節(jié)自噬的分子機(jī)制有利于了解自噬的調(diào)節(jié)因素,并為找尋大腸癌新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。ART1和PARP-1分別可催化單個或多個ADP核糖至目標(biāo)蛋白特定的氨基酸位點(diǎn)促進(jìn)單ADP核糖基化作用或聚ADP核糖基化作用。本課題組前期分別研究ART1和PARP-1對大腸癌發(fā)生發(fā)展的作用,結(jié)果顯示,抑制ART1和PARP-1均可抑制大腸癌腫瘤的增殖和侵襲能力,ART1和PARP-1在順鉑誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡中具有協(xié)同作用。另有文獻(xiàn)報(bào)道,單ADP核糖基化作用可能是聚ADP核糖基化作用的基礎(chǔ),我們推測PARP-1可能會受到ART1的調(diào)節(jié)。亦有文獻(xiàn)報(bào)道,PARP-1可通過mTOR對自噬發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此,本課題擬在前期研究基礎(chǔ)之上,在小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞研究ART1對饑餓誘導(dǎo)的自噬的影響及分子機(jī)制。自噬在生物學(xué)過程中,常與凋亡和增殖有一定關(guān)聯(lián),我們也將進(jìn)一步探討ART1調(diào)節(jié)饑餓誘導(dǎo)的自噬對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響。方法：本研究分為三部分：1.研究ART1對饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的影響。(1)采用D-Hand液體饑餓處理CT26細(xì)胞誘導(dǎo)自噬小體的形成,以慢病毒為載體轉(zhuǎn)染的ART1基因沉默CT26細(xì)胞(ART1-shRNA CT26細(xì)胞)、ART1基因過表達(dá)CT26細(xì)胞(GFP-ART1 CT26細(xì)胞)為實(shí)驗(yàn)組,以慢病毒空載體轉(zhuǎn)染的CT26細(xì)胞(Vector CT26細(xì)胞)和未轉(zhuǎn)染CT26細(xì)胞(Untransfected CT26細(xì)胞)為對照組,通過電鏡、吖啶橙熒光染色方法檢測饑餓誘導(dǎo)的各組CT26細(xì)胞自噬小體形成的變化以及未經(jīng)饑餓誘導(dǎo)的各組CT26細(xì)胞自噬小體形成情況,觀察ART1對饑餓誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞自噬小體形成的影響(2)采用RT-PCR和Western Blot分別檢測饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞、Vector CT26細(xì)胞、GFP-ART1 CT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞以及饑餓誘導(dǎo)的Balb/c小鼠ART1-shRNA CT26細(xì)胞、Vector CT26細(xì)胞、GFP-ART1CT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞皮下移植瘤組織中自噬標(biāo)記蛋白LC3A和LC3B的mRNA和蛋白變化,進(jìn)一步了解ART1對自噬標(biāo)記蛋白LC3A和LC3B表達(dá)的影響。2.研究ART1對饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬影響的分子機(jī)制。(1)采用免疫組化方法檢測人大腸癌組織中PARP-1和ART1的表達(dá)及兩者的相關(guān)性,并通過ART1抑制劑MIBG和PARP-1抑制劑5-AIQ處理CT26細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)記檢測ART1與PARP-1的變化,進(jìn)一步探討ART1和PARP-1之間的作用關(guān)系。采用免疫共沉淀檢測饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞和Vector CT26細(xì)胞中ART1和Integrina7是否存在相互作用。采用Western Blot檢測PARP-1和Rac1抑制劑對饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3A和LC3B的影響；饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞、Vector CT26細(xì)胞、GFP-ART1 CT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞以及饑餓誘導(dǎo)的Balb/c小鼠ART1-shRNA CT26細(xì)胞、Vector CT26細(xì)胞、GFP-ART1 CT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞移植瘤組織中Racl和PAPR-1蛋白水平改變；PARP-1和Rac1抑制劑對饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞中Racl、PARP-1、NF-κB和NF-κB蛋白表達(dá)的影響,探討ART1在饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞中是否通過integrina7/Rac1/NF-κB對PARP-1表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。(2) WesternBlot分別檢測饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞、Vector CT26細(xì)胞、GFP-ART1 CT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞以及饑餓誘導(dǎo)的Balb/c小鼠ART1-shRNA CT26細(xì)胞Vector CT26細(xì)胞、GFP-ART1 CT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞皮下移植瘤組織中LKB1、p-AMPK和p-p70S6蛋白水平；檢測PARP-1和Racl抑制劑對饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞p-AMPK和p-p70S6K蛋白表達(dá)的影響,探討ART1是否通過Rac1、PARP-1調(diào)節(jié)LKB1/AMPK/mTOR途徑進(jìn)而對CT26細(xì)胞饑餓誘導(dǎo)的自噬發(fā)揮作用。3.研究ART1調(diào)節(jié)饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬對癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。(1)自噬抑制劑3-MA處理饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞采用CCK-8、軟瓊脂細(xì)胞集落形成和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖的變化；皮下接種GFP-ART1 CT26細(xì)胞并進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)自噬的BALB/c小鼠腹腔注射3-MA觀察皮下移植瘤成瘤情況,觀察饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞自噬抑制對細(xì)胞增殖的影響。(2)自噬抑制劑3-MA處理饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1CT26細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)、Hochest33342和caspase3活性檢測細(xì)胞凋亡的變化：皮下接種GFP-ART1 CT26細(xì)胞并進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)自噬的BALB/c小鼠腹腔注射3-MA后檢測移植瘤組織中caspase3活性,觀察饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1CT26細(xì)胞自噬抑制對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：1.ARTl對饑餓誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的影響。(1)ART1對饑餓誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞自噬小體形成的影響：1)電鏡下觀察,未經(jīng)過饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNACT26細(xì)胞、Vector CT26細(xì)胞、GFP-ART1 CT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞中均未見自噬小體。在饑餓誘導(dǎo)條件下,與Vector CT26細(xì)胞和Untransfected CT26相比,GFP-ART1 CT26細(xì)胞可見較多的自噬小體,而ART1-shRNA CT26細(xì)胞中幾乎未見自噬小體,但是可見明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。2)吖啶橙熒光染色結(jié)果顯示,在未經(jīng)過饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞、Vector CT26細(xì)胞、GFP-ART1 CT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞中均未見橘紅色熒光。與饑餓誘導(dǎo)的VectorCT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞相比,饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1CT26細(xì)胞中橘紅色熒光最強(qiáng)；饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞中橘紅色熒光非常弱。3)流式細(xì)胞術(shù)定量分析吖啶橙紅色熒光強(qiáng)度,結(jié)果顯示,饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞中橘紅色熒光強(qiáng)度高于饑餓誘導(dǎo)的Vector CT26細(xì)胞和Untransfected CT26細(xì)胞；饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞中橘紅色熒光低于饑餓誘導(dǎo)的Vector CT26細(xì)胞和Untransfected CT26田胞(P0.01)。(2)ART1對饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3A和LC3B的影響。RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示,饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNACT26細(xì)胞和饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞皮下移植瘤中LC3A、LC3B mRNA水平和LC3B/LC3A蛋白比值低于空載對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05),饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞和饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞皮下移植瘤的LC3A、LC3B mRNA水平和LC3B/LC3A蛋白比值則高于空載對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05)。2.ART1對饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬影響的分子機(jī)制。(1)饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞中ART1與integrina7/Racl/NF-κB及PARP-1關(guān)系：1)免疫組化結(jié)果顯示,在人大腸癌組織中,ART1和PARP-1表達(dá)強(qiáng)度均高于對照黏膜組織,且PAPR-1和ART1在人大腸癌組織中陽性表達(dá)具有相關(guān)性。PARP-1和ART1在大腸癌中陽性表達(dá)與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也具有相關(guān)性。2)ART1抑制劑MIBG和PARP-1抑制劑5-AIQ分別處理CT26細(xì)胞,免疫熒光雙標(biāo)記檢測結(jié)果顯示,與未用抑制劑處理的CT26細(xì)胞相比,MIBG處理的CT26細(xì)胞PARP-1和ART1表達(dá)均降低(P0.05)；而5-AIQ處理的CT26細(xì)胞僅有PARP-1表達(dá)降低(P0.05), ART1表達(dá)沒有明顯變化(P0.05)。3)免疫共沉淀方法檢測到ART1和integrinα7在饑餓誘導(dǎo)的CT26細(xì)胞中具有相互作用。4) Western Blot檢測顯示,PARP-1抑制劑5-AIQ或Rac1抑制劑NSC23766處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞LC3 B/LC3A蛋白比值均低于未用相應(yīng)抑制劑處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞(P0.05)。5) Western blot檢測顯示,饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞和饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞皮下移植瘤中Rac1和PAPR-1蛋白表達(dá)水平低于空載對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05),饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞和饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1CT26細(xì)胞皮下移植瘤中的Rac1和PAPR-1蛋白表達(dá)水平則高于空載對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.01)。6)在饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞中,分別應(yīng)用Rac1和PARP-1抑制劑處理后,結(jié)果顯示,Rac1抑制劑處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞PAPR-1和細(xì)胞核NF-κB蛋白水平低于未用抑制劑處理的GFP-ART1 CT26細(xì)胞(P0.05)。Racl的表達(dá)則在PARP-1抑制劑處理的和未用抑制劑處理的饑餓誘導(dǎo)GFP-ART1 CT26細(xì)胞之間無明顯差異(P0.05)。(2)饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞中ART1與LKB1/AMPK/mTOR關(guān)系：1)Western Blot檢測,饑餓誘導(dǎo)的ARTl-shRNA CT26細(xì)胞和饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞皮下移植瘤LKB1和p-AMPK蛋白表達(dá)水平低于空載對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.05),饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞和饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞皮下移植瘤LKB1和p-AMPK蛋白表達(dá)水平則高于空載對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.01)。饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞和饑餓誘導(dǎo)的ART1-shRNA CT26細(xì)胞皮下移植瘤中p-p70S6K蛋白水平高于空載對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.01),饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞和饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞皮下移植瘤中p-p70S6K蛋白水平低于空載對照組和未轉(zhuǎn)染組(P0.01)。2) Westernblot檢測Rac1和PARP-1抑制劑處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞p-AMPK和p-p70S6K變化。與未用抑制劑處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞相比,Rac1抑制劑或PARP-1抑制劑處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞p-AMPK蛋白水平降低(P0.05)。p-p70S6K在Rac1抑制劑或PARP-1抑制劑處理的的饑餓誘導(dǎo)GFP-ART1 CT26細(xì)胞中表達(dá)升高(P0.05)。3.ART1調(diào)節(jié)饑餓誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬對癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。(1)ART1調(diào)節(jié)的饑餓誘導(dǎo)CT26細(xì)胞自噬對癌細(xì)胞增殖的影響。1)采用CCK-8觀察不同濃度的自噬抑制劑3-MA對饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞增殖水平的影響,結(jié)果顯示,在一定范圍內(nèi),隨著3-MA濃度逐漸增加饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞的生長抑制率也逐漸增加。5mM 3-MA抑制饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)增殖的效果強(qiáng)于1 mM和3mM 3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞(P0.05)。但是5 mM 3-MA對饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞抑制率和7mM 3-MA對饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞抑制率之間無明顯差異(P0.05)。2)軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞集落形成率低于未用3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞(P0.05)。3)流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與未用3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞相比,3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞在細(xì)胞周期中分布比例發(fā)生變化,S期和G2期所占比例縮小以及細(xì)胞增殖指數(shù)降低(P0.05)。4)皮下接種GFP-ART1 CT26細(xì)胞并進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)自噬的BALB/c小鼠腹腔注射3-MA后觀察皮下移植瘤體積和重量的變化。結(jié)果顯示,3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞移植瘤體積和重量均小于未用3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞移植瘤(P0.05)。(2)ART1調(diào)節(jié)的饑餓誘導(dǎo)CT26細(xì)胞自噬對癌細(xì)胞凋亡的影響。1)流式細(xì)胞術(shù)檢測自噬抑制劑3-MA對饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1CT26細(xì)胞凋亡率明顯高于未用3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1CT26細(xì)胞(P0.01)。2) Hochest33342染色觀察3-MA對饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示,3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞凋亡率高于未用3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞(P0.01)。3)3-MA對的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1CT26細(xì)胞caspase3活性的影響,結(jié)果顯示,3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1CT26細(xì)胞和caspase3活性高于未用3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1CT26細(xì)胞(P0.05)；皮下接種GFP-ART1 CT26細(xì)胞并進(jìn)行饑餓誘導(dǎo)自噬的BALB/c小鼠腹腔注射3-MA后檢測皮下移植瘤組織caspase3活性的變化,結(jié)果顯示,3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞移植瘤中caspase3活性高于未用3-MA處理的饑餓誘導(dǎo)的GFP-ART1 CT26細(xì)胞移植瘤(P0.05)。結(jié)論：1.ART1高表達(dá)可促進(jìn)饑餓誘導(dǎo)的CT26細(xì)胞自噬小體的形成,ARTl沉默可抑制饑餓誘導(dǎo)的CT26細(xì)胞自噬小體的形成,ART1對結(jié)腸癌CT26細(xì)胞饑餓誘導(dǎo)的自噬具有調(diào)節(jié)作用。2.ART1可通過integrina7相互作用,調(diào)節(jié)Rac1、NF-κB、PARP-1、AMPK和mTOR信號通路,在饑餓誘導(dǎo)的CT26細(xì)胞自噬形成中發(fā)揮作用。3.抑制ART1促進(jìn)的饑餓誘導(dǎo)的CT26細(xì)胞自噬,可以抑制該細(xì)胞增殖和促進(jìn)該細(xì)胞凋亡。ART1可能成為新的大腸癌治療靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35

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本文編號：1858498