本文選題：HepaRG + 定量膜蛋白質(zhì)組學(xué)　； 參考：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：在我國(guó),每年有超過(guò)30萬(wàn)人死于肝癌,占全世界因肝癌死亡患者的55%以上。作為“癌中之王”的肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)在原發(fā)性肝癌中的比例超過(guò)90%。肝癌具有惡性程度高、發(fā)生發(fā)展迅速、容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)以及預(yù)后生存期短的特點(diǎn)。由于缺乏早期肝癌診斷相關(guān)的生物標(biāo)志物,臨床診斷主要依靠檢測(cè)AFP(α-fetoprotein,甲胎蛋白)表達(dá)和采用醫(yī)學(xué)影像如B超等進(jìn)行早期篩查。但是AFP陽(yáng)性率與肝癌只有70-80%的相關(guān)性以及B超難于診斷早期的小體積肝癌等缺點(diǎn),使得肝癌早期診斷難于實(shí)現(xiàn)。手術(shù)切除仍是肝癌治療的首要選擇,但是HCC易轉(zhuǎn)移的特征使肝癌患者的術(shù)后生存期非常短。對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究從而尋找與轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物,對(duì)肝癌的預(yù)防、診斷和治療具有非常重要的理論意義和應(yīng)用前景。與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制之一是在腫瘤微環(huán)境變化如缺氧誘導(dǎo)引起的腫瘤組織中上皮細(xì)胞間質(zhì)化轉(zhuǎn)化(EMT),從而使腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能。在HCC轉(zhuǎn)移過(guò)程中,由于病毒感染等因素造成的肝損傷以及HCC腫瘤微環(huán)境改變使肝臟中部分細(xì)胞的膜蛋白和胞外基質(zhì)組成發(fā)生變化進(jìn)而調(diào)控下游信號(hào)通路,使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成具有某些“干性”的肝祖細(xì)胞,肝祖細(xì)胞可以分化成肝癌相關(guān)成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞從而發(fā)生HCC轉(zhuǎn)移。因此,對(duì)EMT發(fā)生過(guò)程中的膜蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究對(duì)闡述HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制非常重要。本研究通過(guò)優(yōu)化組合超速離心和雙水相提取方法優(yōu)化了膜蛋白質(zhì)組樣品制備的完整流程,獲得了純度接近40%的膜蛋白富集組分。在此基礎(chǔ)上,系統(tǒng)比較和優(yōu)化了膜蛋白的電泳分離、膠內(nèi)酶切、溶液酶切、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和膜蛋白預(yù)測(cè)方法等。研究表明基于組合酶切(Lys C+trypsin)的膠內(nèi)消化可以鑒定超過(guò)1000個(gè)膜蛋白。進(jìn)一步組合RapiGest的溶液酶切和高pH-RPLC分離技術(shù),形成了簡(jiǎn)便、快速、高效的膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)體系�；谠摷夹g(shù)體系獲得的HepaRG和MCF7細(xì)胞系膜蛋白數(shù)據(jù)集在膜蛋白數(shù)量上優(yōu)于目前文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)集(Rui,2013,486個(gè)膜蛋白;Hu,2011,495個(gè)膜蛋白)�；诳审w外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化的肝祖細(xì)胞系HepaRG,建立了HepaRG的體外誘導(dǎo)分化體系并對(duì)分化前后的膜蛋白進(jìn)行iTRAQ定量膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析。對(duì)最終定量的849個(gè)膜蛋白進(jìn)行差異表達(dá)篩選和IPA(Ingenuity pathway analysis)分析表明,ECM組成相關(guān)膜蛋白對(duì)HepaRG細(xì)胞的分化非常重要,多個(gè)膜蛋白參與了細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)移和癌癥相關(guān)信號(hào)通路。其中關(guān)鍵的蛋白包括MMP14、HYOU1、CD44、OCLN、ITGA、EGFR、ADAM9、ADAM15、CD46、CD151以及TMEM家族蛋白。這些蛋白的變化與EMT過(guò)程密切相關(guān),進(jìn)一步證明HepaRG細(xì)胞的肝祖細(xì)胞系屬性。對(duì)HCC細(xì)胞系和組織樣本的進(jìn)一步研究表明MMP14在HCC轉(zhuǎn)移中的重要作用。本研究關(guān)于HepaRG細(xì)胞分化前后的定量膜蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)初步闡釋了該細(xì)胞分化的分子機(jī)制,為進(jìn)一步研究肝組細(xì)胞在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步研究HCC轉(zhuǎn)移過(guò)程中膜蛋白參與的分子機(jī)制和潛在的膜蛋白分子標(biāo)志物,對(duì)MHCC97L和HCCLM6進(jìn)行基于定量膜蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的比較分析、IPA分析。最后基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因(蛋白)在肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)特性以及HCC病人臨床表達(dá)差異與生存期的相關(guān)性進(jìn)行研究以尋找與HCC相關(guān)的膜蛋白分子標(biāo)志物。無(wú)標(biāo)定量膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明96個(gè)膜蛋白在LM6細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),48個(gè)膜蛋白在LM6細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。在轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序的16,558個(gè)蛋白編碼基因中,1,472個(gè)基因符合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的差異表達(dá)(log2Ratio1或者-1,p-value0.05)。IPA對(duì)轉(zhuǎn)錄組差異基因分析表明,細(xì)胞系的差異主要集中在胞外基質(zhì)和細(xì)胞膜蛋白上;參與膜蛋白組成變化的信號(hào)通路包括TGF-β、VEGF、IL6、EGFR、TNF-α和FGF等;這些信號(hào)通路相關(guān)分子的變化都與胞外金屬基質(zhì)蛋白酶如MMP14介導(dǎo)的膠原蛋白、鈣粘素、整合素代謝途徑相關(guān)。轉(zhuǎn)錄組和定量膜蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中共同差異部分基因(蛋白)的進(jìn)一步IPA分析表明膜蛋白組成變化與粘附、轉(zhuǎn)移和癌癥的相關(guān)性。對(duì)共同差異基因(蛋白)基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC癌癥和癌旁樣本的相關(guān)表達(dá)量比較分析表明,29個(gè)基因在癌癥和癌旁組織中表達(dá)差異明顯,其中12個(gè)基因的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.0001)。對(duì)差異表達(dá)基因與HCC的生存曲線的進(jìn)一步分析表明ATR、CHST11、FMO3、MOCS2、NUCB2和ST6GALNAC4對(duì)HCC的轉(zhuǎn)移具有非常高的相關(guān)性,這些基因可以作為潛在的膜蛋白分子標(biāo)志物在臨床研究中進(jìn)一步研究。本文優(yōu)化的多組學(xué)整合分析方法為進(jìn)一步研究HCC的發(fā)生發(fā)展提供了新的研究思路。
[Abstract]:In China , more than 300,000 people died of liver cancer every year , accounting for more than 55 % of patients with liver cancer . In order to further study the molecular mechanism of membrane protein involved in HCC metastasis and to investigate the role of membrane protein in HCC metastasis .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
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本文編號(hào)：1842357