本文選題：非小細胞肺癌 + 侵襲轉(zhuǎn)移　； 參考：《山東大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：肺癌尤其是非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)具有高發(fā)病率、高轉(zhuǎn)移性、易復(fù)發(fā)和易耐藥等特性,已成為全球范圍內(nèi)致死性最高的癌癥。絕大多數(shù)患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移,而且約30%的手術(shù)切除后患者發(fā)生復(fù)發(fā)甚至死亡,所以針對非小細胞肺癌的預(yù)防轉(zhuǎn)移治療及藥物研發(fā)成為亟待解決的難題。研究表明超過60%的非小細胞肺癌患者癌細胞過表達EGFR,而使用酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)是最佳治療方案,然而至今仍沒有藥物能有效提高總存活率。其中最大的挑戰(zhàn)是過表達受體酪氨酸激酶(RTK)的癌細胞會通過PI3K信號通路抵抗TKIs的作用。大量研究表明PI3K/Ak t信號網(wǎng)絡(luò)在NSCLC誘發(fā)及轉(zhuǎn)移中具有重要作用。許多NSCLC早期患者的原發(fā)癌組織和轉(zhuǎn)移前沿中發(fā)現(xiàn)有PIK3CA基因的擴增、PI3K蛋白的高表達以及信號通路下游因子Akt、mTOR、PTEN的異常表達,靶向該信號通路中關(guān)鍵酶的抗癌藥物開發(fā)已成為腫瘤預(yù)防和治療的突破點。目前,雖已有PI3K通路抑制劑進入臨床應(yīng)用于部分患者,但針對這一通路的靶向小分子抑制劑的開發(fā)依舊是藥物研發(fā)領(lǐng)域的熱點。小分子化合物S14161 (8-乙氧基-2-(4-氟苯基)-3-硝基-2氫-苯并吡喃)是3-硝基苯并吡喃類外消旋化合物,是一種PI3K抑制劑,但由于其手性結(jié)構(gòu)和較差的溶解性能抑制了其進一步的應(yīng)用。為獲得活性更優(yōu)的化合物,我院藥化研究所劉兆鵬教授對S14161的結(jié)構(gòu)進行了簡化,去除2位的4-氟苯基,發(fā)現(xiàn)了活性更好的3-硝基-2H-苯并吡喃類抗腫瘤衍生物BENC-511(6-溴-8-乙氧基-3-硝基-2氫-苯并吡喃)。前期實驗顯示BENC-511主要作用于PI3K/Akt通路,能顯著抑制腫瘤細胞中Akt的磷酸化程度及下游信號蛋白的表達,具有良好的抗白血病和多發(fā)性骨髓瘤活性和較低毒性,但對非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用未見報道。本課題主要從體外及體內(nèi)水平考察BENC-511在抑制非小細胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用,并進一步通過檢測PI3K相關(guān)信號通路蛋白的表達以及蛋白間相互作用闡明其作用機制。通過考察該化合物在抑制肺癌轉(zhuǎn)移方面的作用,進一步完善其抗腫瘤活性研究,并為尋找新的作用靶點、研發(fā)新型抗肺癌轉(zhuǎn)移藥物提供理論依據(jù)。實驗方法及結(jié)果體外試驗：應(yīng)用人非小細胞肺癌細胞株A549和人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC,采用劃痕試驗觀察化合物BENC-511(5和10μmol/L) 和S14161對細胞遷移的抑制作用；用Transwell小室試驗檢測BENC-511(10、5、2.5、1.25μmol/L)和S14161 (10μmol/L)對A549細胞侵襲的抑制作用。結(jié)果顯示,BENC-511可抑制HUVEC細胞遷移能力；可抑制A549細胞遷移及侵襲能力。體內(nèi)試驗：采用C57BL/6J、鼠尾靜脈注射B16BL6黑色素瘤細胞從而構(gòu)建癌細胞實驗性肺轉(zhuǎn)移模型,持續(xù)灌胃給藥BENC-511(20和40mg/kg)兩周,取小鼠雙肺,計數(shù)黑色轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)；采用A549-luc-GFP細胞在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建實驗性肺轉(zhuǎn)移模型,連續(xù)灌胃給藥2周,期間在第10天及14天用生物發(fā)光小動物活體成像儀觀察瘤體積變化及轉(zhuǎn)移情況。另外采用裸鼠移植瘤試驗,小鼠腋下接種A549-luc-GFP細胞構(gòu)建小鼠荷瘤模型,連續(xù)給藥20天觀察BENC-511對腫瘤生長的抑制情況。結(jié)果顯示,BENC-511可抑制B16B L6及A549細胞實驗性肺轉(zhuǎn)移,且抑制A549細胞裸鼠移植瘤的生長。為研究BENC-511抑制肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制,采用瓊脂糖凝膠酶譜檢測化合物BENC-511對A549細胞培養(yǎng)液中的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2. MMP-9)活性的影響；并用Western Blotting檢測兩種酶及相關(guān)信號通路蛋白表達。結(jié)果顯示,BENC-511可抑制MMP-9的酶活性及蛋白表達,降低PI3K, Akt、 mTOR及其磷酸化形式蛋白表達,降低磷酸化EGFR蛋白表達,升高GSK3P表達從而降低細胞核內(nèi)、外β-catenin表達量以及其靶基因ZEB1的轉(zhuǎn)錄。為進一步探討化合物BENC-511抑制肺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制是否與ZEB1相關(guān),使用劃痕試驗檢測到H460、A549、H1299三種NSCLC細胞具有不同的侵襲特性,呈遞增趨勢。BENC-511對H1299細胞中ZEB1蛋白表達抑制率最高,且作用72h后的IC50值最低。隨后,使用shRNA干擾細胞中ZEB1表達,發(fā)現(xiàn)細胞中的MMP-9、VEGF、β-catenin表達降低,E-cadherin、PTEN、P53表達增高,且BENC-511對細胞增殖及侵襲的抑制率提高。結(jié)論化合物BENC-511能抑制鼠黑色素瘤B16BL6細胞及肺癌A549細胞體內(nèi)、外侵襲轉(zhuǎn)移；其作用主要是通過直接抑制EGFR磷酸化,以及抑制PI3K/mTOR/β-catenin信號通路從而下調(diào)MMP-9實現(xiàn)的。BENC-511對非小細胞肺癌細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制與ZEB1、β-catenin表達高低相關(guān)；shRNA降低ZEB1表達后可提高BENC-511對A549細胞活力和侵襲能力的抑制效果。
[Abstract]:Non - small cell lung cancer ( NSCLC ) , especially non - small cell lung cancer ( NSCLC ) , has the characteristics of high morbidity , high metastatic ability , easy recurrence and drug resistance , and has become the most fatal cancer in the world .
The inhibitory effect of BENC - 511 ( 10 , 5 , 2.5 , 1.25 渭mol / L ) and S14161 ( 10 渭mol / L ) on the invasion of A549 cells was investigated by Transwell chamber assay .
In vivo experiment : B16BL6 melanoma cells were injected intravenously with C57BL / 6 J mice , and B16BL6 melanoma cells were injected intravenously to construct the experimental lung metastasis model of cancer cells . Two weeks after administration of BENC - 511 ( 20 and 40mg / kg ) , mice were given double lung and counted the nodules of black metastatic tumor ;
The experimental lung metastasis model was constructed in nude mice by A549 - luc - GFP cells . The tumor volume changes and metastasis were observed in vivo on the 10th day and the 14th day . The results showed that BENC - 511 inhibited the experimental lung metastasis of B16B L6 and A549 cells and inhibited the growth of tumor growth in A549 cells . The results showed that BENC - 511 inhibited the growth of B16B L6 and A549 cells . MMP - 9 activity ;
The results showed that BENC - 511 inhibited the expression of MMP - 9 , reduced its expression , decreased the expression of phosphorylated EGFR protein , increased the expression of phosphorylated EGFR protein , increased the expression of extracellular 尾 - catenin and the transcription of its target gene . The results showed that the expression of MMP - 9 , VEGF , 尾 - catenin in the cells decreased , E - cadherin , PTEN and P53 increased , and BENC - 511 inhibited the proliferation and invasion of human lung cancer cells .
The effect of BENC - 511 on the proliferation and invasion and metastasis of non - small cell lung cancer cells is related to the expression of zeB1 and 尾 - catenin .
The inhibitory effect of BENC - 511 on the viability and invasion ability of A549 cells can be improved after the shRNA has been reduced by the shRNA .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1833576