本文選題：肝細胞肝癌 + 性別差異�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：原發(fā)性肝癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一,尤其是包括我國在內(nèi)的東亞地區(qū)。盡管目前已有多種治療手段,肝癌致死率仍然很高,在男性腫瘤相關(guān)死亡中高居第二位,在女性腫瘤相關(guān)死亡中也排在第六位。原發(fā)性肝癌80%以上屬于肝細胞肝癌,肝癌的主要危險因素包括肝炎病毒感染、化學(xué)致癌因子、酒精性及非酒精性肝硬化、二型糖尿病及吸煙等。肝癌的另一特征是男女發(fā)病率存在差異,男性肝癌發(fā)病率明顯高于女性。長期以來,針對肝癌性別差異現(xiàn)象的研究證明了性激素通路及炎性因子等在其中的重要作用,然而肝癌激素治療和去勢治療并沒有取得理想的治療效果,反而產(chǎn)生較大的副作用。因此,肝癌發(fā)生的性別差異機制仍有待于進一步研究。遺傳物質(zhì)的角度,男女之間最大的差異是性染色體的區(qū)別(XXXY),然而性染色體編碼基因的研究亦未能解釋肝癌的性別差異現(xiàn)象。長鏈非編碼RNA是近期的研究熱點,是長度超過200nt的不具備蛋白編碼能力的轉(zhuǎn)錄本,以RNA形式參與了多種生理及病理過程。本研究中,我們關(guān)注性染色體轉(zhuǎn)錄的長鏈非編碼RNA與肝癌發(fā)生及性別的關(guān)系和作用機制。女性體細胞兩條X染色體中一條發(fā)生失活,以平衡不同性別之間的基因劑量,稱為X染色體失活(X chromosome inactivation,XCI)。然而,近期研究發(fā)現(xiàn)一些位于X染色體失活中心的基因發(fā)生逃逸現(xiàn)象,在失活的染色體上仍有表達,這將重新導(dǎo)致男女基因表達失衡,在女性器官中高水平表達。女性肝臟中是否存在失活逃逸,逃逸基因是否能夠在女性肝臟中發(fā)揮保護作用,抵抗肝癌發(fā)生。Y染色體是男性特有的染色體,尤其是男性特異性區(qū)(male specific region of the Y-chromosome,MSY),編碼男性特異性基因。Y染色體特異性基因在男性肝癌中是否有特異性的激活,是否與男性肝癌高發(fā)有關(guān)。針對以上科學(xué)問題,我們設(shè)計本研究,探索性染色體非編碼轉(zhuǎn)錄本在肝癌性別差異形成中的功能。通過對逃逸基因的篩選,我們發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA FTX(lnc-FTX)在女性肝組織中的表達高于男性。lnc-FTX在肝癌中被下調(diào),肝癌組織中l(wèi)nc-FTX的表達水平與肝癌病人預(yù)后相關(guān),高水平的lnc-FTX預(yù)示病人預(yù)后較好,術(shù)后生存期較低表達組更長。體外細胞實驗證實,lnc-FTX能夠抑制肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。裸鼠體內(nèi)實驗證實,lnc-FTX能夠抑制肝癌細胞體內(nèi)成瘤。lnc-FTX干擾的QSG7701細胞系裸鼠皮下荷瘤實驗說明,干擾lnc-FTX能夠促進肝細胞系皮下成瘤,促進惡性轉(zhuǎn)化。RNA pull-down和RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)實驗證明,lnc-FTX結(jié)合MCM2蛋白,阻礙MCM2蛋白結(jié)合染色體組裝DNA復(fù)制復(fù)合物的過程,導(dǎo)致DNA復(fù)制阻滯,從而抑制肝癌細胞的增殖。lnc-FTX還通過序列互補方式結(jié)合吸附mi R-374a,RNA pull-down實驗和MS2-RIP實驗證明lnc-FTX與mi R-374a的直接結(jié)合。雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實lnc-FTX是mi R-374a的靶基因。RT-PCR實驗和蛋白免疫印跡實驗證明,lnc-FTX能夠上調(diào)mi R-374a的靶基因Wnt5A、WIF1和PTEN,而且對三者的調(diào)控作用通過mi R-374a實現(xiàn)。Wnt5A、WIF1和PTEN是Wnt/β-Cantenin信號通路負向調(diào)控因子,lnc-FTX能夠通過上調(diào)三者表達而抑制Wnt/β-Cantenin信號通路活性,這一抑制作用由β-Cantenin報告系統(tǒng)TOP/FOPflash活性和Wnt通路活化基因表達水平證實。lnc-FTX抑制Wnt/β-Cantenin信號通路活性,抑制肝癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程,降低了肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲的能力。RNA原位雜交和蛋白免疫熒光實驗證實,lnc-FTX在胞核中與MCM2蛋白結(jié)合,在胞漿中則能夠結(jié)合mi R-374a,從而同時發(fā)揮抑制增殖和抑制轉(zhuǎn)移的功能。lnc-FTX對肝癌的性別差異影響體現(xiàn)在它對女性的保護作用。肝癌發(fā)生前,女性肝組織中高水平的lnc-FTX通過結(jié)合并抑制MCM2,影響DNA復(fù)制復(fù)合物的組裝,導(dǎo)致DNA復(fù)制和細胞增殖阻滯,從而抑制肝細胞異常增生,防止肝細胞的惡性轉(zhuǎn)化。肝癌發(fā)生后,女性高水平的lnc-FTX結(jié)合吸附mi R-374a,減少游離mi R-374a,抑制Wnt/β-Cantenin信號通路和肝癌EMT過程,減少肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移,從而減緩肝癌進展。我們比較Y染色體轉(zhuǎn)錄本在男性肝癌組織和癌旁組織的表達差異發(fā)現(xiàn),長鏈非編碼RNA RBMY2FP(RNA binding motif protein,Y-linked,family 2,member F pseudogene,lnc-RBMY2FP)是差異最明顯的轉(zhuǎn)錄本。進一步通過PCR檢測發(fā)現(xiàn),lnc-RBMY2FP僅在約1/3男性肝癌組織中特異性的活化表達,癌旁組織和女性組織中均無表達。我們還檢測了肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和食管癌等組織,lnc-RBMY2FP均呈陰性。lnc-RBMY2FP陽性表達病人預(yù)后結(jié)果更差,術(shù)后生存期明顯短于陰性病人。體外實驗和裸鼠體內(nèi)實驗證明,lnc-RBMY2FP能夠促進肝癌細胞增殖和成瘤。亞硫酸氫鹽甲基化測序法發(fā)現(xiàn),陽性肝癌組織中RBMY2FP基因啟動子區(qū)Cp G甲基化程度明顯降低,lnc-RBMY2FP的活化與啟動子區(qū)去甲基化有關(guān)。RNA pull-down和RIP實驗證明lnc-RBMY2FP能夠結(jié)合DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)。染色質(zhì)免疫共沉淀實驗(chromatin immunoprecipitation,CHIP)證實,lnc-RBMY2FP抑制DNMT1與RBMY基因簇啟動子區(qū)的結(jié)合,導(dǎo)致該區(qū)域發(fā)生去甲基維持障礙,發(fā)生異常的低甲基化,激活RBMY1A1基因表達,促進腫瘤的增殖和生長。綜上所述,我們對肝癌性別差異進行了深入研究,發(fā)現(xiàn)性染色體編碼的非編碼RNA在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的重要作用,發(fā)現(xiàn)了與女性肝癌抵抗相關(guān)的抑制因子lncFTX和男性肝癌特異性的促癌因子lnc-RBMY2FP,有助于肝癌性別差異的解釋,并且為肝癌預(yù)防和治療提供潛在的靶點。
[Abstract]:Primary liver cancer is one of the most common malignant tumors in the world , especially in the East Asia region , including our country . Although there are many kinds of treatment methods , the death rate of liver cancer is still very high . The main risk factors of liver cancer include hepatitis virus infection , chemical carcinogen factor , alcoholic and non - alcoholic cirrhosis , type 2 diabetes and smoking . In vivo experiments , we found that lnc - FTX can inhibit the proliferation and metastasis of liver cancer cells . In vivo experiments prove that lnc - FTX can inhibit the proliferation and metastasis of liver cancer cells . In vivo experiments prove that lnc - FTX can inhibit the proliferation and metastasis of liver cancer cells . In vitro and in vivo experiments prove that lnc - RBMY2FP can inhibit the proliferation and proliferation of hepatocellular carcinoma . In vitro and in vivo experiments prove that lnc - RBMY2FP can bind to DNA methyltransferase 1 ( DNMT2 ) . In vitro and in vivo experiments prove that lnc - RBMY2FP can bind to DNA methyltransferase 1 ( DNMT2 ) . In conclusion , we find that lnc - RBMY2FP can bind to DNA methylase 1 ( DNMT2 ) . and provides a potential target for the prevention and treatment of liver cancer .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1832333