本文選題：大腸癌 + 蛋白質(zhì)組學(xué)　； 參考：《吉林大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：大腸癌（Colorectal Cancer CRC）包括直腸癌和結(jié)腸癌，是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在世界居惡性腫瘤的第三位[1]。據(jù)統(tǒng)計，在中國大腸癌的發(fā)病率是13.29每10萬人[2]，并且發(fā)病率逐年增高。大腸癌的死亡率也在逐年上升，大腸癌排在了腫瘤相關(guān)死亡原因的男性中第二位、女性中第三位[3]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，大腸癌患者術(shù)后5年生存率達(dá)到了50%~70%，相比之前有了較大的提高[4]。有文獻(xiàn)報道無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌患者，術(shù)后五年生存率可達(dá)90%[5]，而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌患者，術(shù)后五年生存率一般只有65%[6,7]�？梢娙绻軐Υ竽c癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，不僅能有效地延長患者的生命，也可以極大地改善患者的生存質(zhì)量。但由于病情的隱匿，很多大腸癌患者就診時已到了中晚期，錯失了最佳的治療時機(jī)。因此探尋能早期診斷大腸癌的高敏感、高特異的方法是我們一直以來努力的目標(biāo)。目前在學(xué)術(shù)界廣泛被關(guān)注的是分子標(biāo)志物，因腫瘤標(biāo)志物檢測簡便、快速、創(chuàng)傷小、易于接受，在臨床中被廣泛應(yīng)用。但由于腫瘤基因的復(fù)雜性，目前還很難發(fā)現(xiàn)一個敏感度高、特異性高的大腸癌的腫瘤標(biāo)志物。近些年來興起的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，為我們打開了一扇窗。以蛋白質(zhì)組學(xué)為主體的支撐技術(shù)為大腸癌的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的手段和支持。我們可以比較分析正常個體和病理個體之間的差異蛋白質(zhì)，找到具有疾病特異性的蛋白質(zhì)分子，從而為疾病的早期預(yù)測和輔助診斷提供有效的分子標(biāo)志。這對大腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療都將會有很大的幫助。 本研究擬應(yīng)用二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測大腸癌組織與癌旁組織之間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，從而構(gòu)建大腸癌的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，以期篩選出可用于輔助診斷大癌腸的分子標(biāo)記物。在本研究中由于各方面限制不能對篩選出的所有差異蛋白質(zhì)一一做深入的研究，我們從表達(dá)差異的蛋白質(zhì)譜中篩選出上調(diào)蛋白PDIA3作為目標(biāo)蛋白，采用免疫組織化學(xué)方法驗(yàn)證其在大腸癌病人中的表達(dá)情況，并對相關(guān)的病理參數(shù)之間進(jìn)行了分析。之后我們分析了PDIA3蛋白在不同的大腸癌細(xì)胞株的表達(dá)情況，構(gòu)建了PDIA3siRNA的慢病毒表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染表達(dá)PDIA3蛋白較高的SW480細(xì)胞，在通過RNA干擾技術(shù)，檢測PDIA3蛋白的表達(dá)對大腸癌SW480細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)、增殖的影響，從而進(jìn)一步了解了PDIA3蛋白在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。我們的主要研究結(jié)果如下： 第一部分建立TNMⅢ期大腸癌與癌旁組織的差異蛋白譜 方法： 1、研究對象：23例TNMⅢ期大腸癌患者，大腸癌組織及配對的癌旁腸粘膜組織標(biāo)本。 2、提取樣品組織中的總蛋白，分析蛋白質(zhì)的濃度。 3、制備蛋白水解多肽混合物的樣本。 4、二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，數(shù)據(jù)庫檢索分析。 5、免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果： 1、大腸癌組織：收集、整理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，共獲得846個蛋白質(zhì)的鑒定材料。 2、配對癌旁腸粘膜組織：收集、整理質(zhì)譜數(shù)據(jù)，共獲得535個蛋白質(zhì)的鑒定材料。 3、對比分析大腸癌組織與配對癌旁腸粘膜組織的蛋白質(zhì)譜，共獲得24個具有顯著性差異的蛋白質(zhì)，其中在大腸癌組織中有9個蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，15個蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。 4、免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蛋白PDIA3在大腸癌組織中的上調(diào)表達(dá)。 第二部分大腸癌病人PDIA3表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 方法： 1、建立臨床病理資料數(shù)據(jù)庫。 2、免疫組化法驗(yàn)證PDIA3在大腸癌中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。 結(jié)果： 1、免疫組化證實(shí)PDIA3在大腸癌病人中高度表達(dá)，，主要表達(dá)在胞漿。 2、在30例大腸癌組織中有28例(93.3%)PDIA3蛋白表達(dá)呈陽性，30例配對癌旁腸粘膜組織中有21例(70.0%)PDIA3蛋白表達(dá)呈陽性。雖然從陽性率上兩者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但從表達(dá)強(qiáng)度上來看，與配對癌旁腸粘膜組織相比較，大腸癌組織中PDIA3蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.01）。 3、PDIA3蛋白的表達(dá)與大腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（p0.05），而與病人的性別、年齡、TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)(p0.05)。 第三部分：PDIA3蛋白在大腸癌細(xì)胞株中相關(guān)生物學(xué)功能的研究 方法： 1、PDIA3蛋白在大腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)。 2、PDIA3siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和質(zhì)粒擴(kuò)增。 3、PDIA3siRNA轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞PDIA3mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。 4、PDIA3siRNA轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞凋亡的影響。 5、PDIA3siRNA轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變。 6、PDIA3siRNA轉(zhuǎn)染對SW480細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果： 1、PDIA3蛋白在不同的大腸癌細(xì)胞株中均有不同程度的表達(dá)，其中在SW480細(xì)胞株中表達(dá)最強(qiáng)。 2、構(gòu)建的PDIA3siRNA慢病毒重組表達(dá)載體能夠高效轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞(p0.01)。 3、構(gòu)建的PDIA3siRNA慢病毒重組表達(dá)載體能有效沉默PDIA3基因mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.01）。 4、轉(zhuǎn)染PDIA3siRNA的SW480細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯高于轉(zhuǎn)染PDIA3control組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.01）。 5、PDIA3siRNA轉(zhuǎn)染后，SW480細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 6、PDIA3siRNA轉(zhuǎn)染后，SW480的細(xì)胞活性明顯下降，生長受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p0.05）。 通過以上研究，我們得出以下結(jié)論： 1.建立了TNMⅢ期大腸癌組織與配對癌旁腸粘膜組織的差異蛋白質(zhì)譜。 2.免疫組化法顯示PDIA3蛋白在大腸癌病人中高表達(dá)，且表達(dá)水平與大腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（p0.05），而與病人的性別、年齡、TNM分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)(p0.05)。 3.篩選出能高表達(dá)PDIA3蛋白的SW480細(xì)胞株，構(gòu)建了能高效抑制PDIA3基因表達(dá)的GV248慢病毒載體，利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒有效地轉(zhuǎn)染到大腸癌SW480細(xì)胞中。 4. PDIA3siRNA轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生了明顯改變： SW480細(xì)胞中PDIA3mRNA的表達(dá)下降、SW480細(xì)胞的凋亡明顯、SW480細(xì)胞的亞結(jié)構(gòu)被改變、SW480細(xì)胞的增殖被抑制，可見PDIA3在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Colorectal Cancer CRC, including rectal cancer and colon cancer, is one of the common malignant tumors of the digestive system. The incidence of colorectal cancer is third [1]. statistics in the world. The incidence of colorectal cancer in China is 13.29 per 100 thousand [2], and the incidence of colorectal cancer is increasing year by year. Second of the second male patients with tumor related death, third of the women with the continuous development of medical technology, the 5 year survival rate of colorectal cancer patients reached 50%~70%. Compared with the previous higher [4]., the patients with colorectal cancer without lymph node metastasis were reported to have a five year survival rate of 90%[5]. The five year survival rate of colorectal cancer patients with lymph node metastasis is generally only 65%[6,7]., which can be found early, early diagnosis, early treatment, not only can effectively prolong the life of the patients, but also greatly improve the quality of life of the patients. But because of the concealment of the disease, many patients with large intestine cancer have been in the middle and late stages. It's the best time to treat it. Therefore, it is our goal to explore the high sensitivity and high specificity of the early diagnosis of colorectal cancer. The molecular markers are widely concerned in the academic world. The tumor markers are easily detected, fast, small, easy to accept, and are widely used in clinical. It is difficult to find a tumor marker of high sensitivity and high specificity of colorectal cancer. The proteomics technology has opened a window in recent years. The support technology with proteomics as the main body provides a powerful means and support for the basic and clinical application of colorectal cancer. A comparative analysis of the differential proteins between normal and pathological individuals and the finding of protein molecules with disease specificity can provide an effective molecular marker for early prediction and auxiliary diagnosis of disease, which will be of great help to the early detection, diagnosis and treatment of colorectal cancer.
The purpose of this study is to detect the differential protein expression between colorectal cancer tissues and adjacent tissues by two-dimensional chromatography and mass spectrometry, and to construct the differential protein expression profiles of colorectal cancer in order to screen out the molecular markers that can be used to assist the diagnosis of large intestine cancer. In depth study, we screened the up - regulated protein PDIA3 as the target protein from the differential protein mass spectrum, and demonstrated the expression in colorectal cancer patients by immunohistochemistry and analyzed the related pathological parameters. After that, we analyzed the PDIA3 protein in different colorectal cancer. The expression of PDIA3siRNA was constructed, and the expression vector of lentivirus was constructed to express the SW480 cells with high PDIA3 protein. The effect of PDIA3 protein expression on the apoptosis, substructure and proliferation of colorectal carcinoma SW480 cells was detected by RNA interference technique. Thus the PDIA3 protein was further understood in the development and development of colorectal cancer. The main results of our research are as follows:
The first part is to establish differential protein profiles of colorectal cancer and paracancerous tissues in stage TNM III.
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本文編號：1830189