本文選題：肝癌 + 腫瘤相關(guān)性巨噬細胞��； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分人原發(fā)性肝細胞癌中腫瘤相關(guān)性巨噬細胞CD206的表達分析目的:使用肝癌組織芯片研究腫瘤相關(guān)性巨噬細胞(TAM)標(biāo)記物CD206的表達與原發(fā)性肝癌(HCC)預(yù)后的關(guān)系并分析其臨床特點。方法:選取并收集手術(shù)時間于2010年1月-2011年9月,隨訪時間截止至2013年9月,共隨訪2-3.7年的原發(fā)性肝細胞癌患者共90例,采集病史,獲取包含性別、年齡、肝功能、腫瘤分期等完整臨床數(shù)據(jù),并于術(shù)后將肝癌內(nèi)及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本,制作成10*18共180點微陣列組織芯片(癌內(nèi)及癌旁組織各1點)。免疫組織化學(xué)(IHC)檢測組織芯片中腫瘤相關(guān)性巨噬細胞標(biāo)記物CD206在肝癌內(nèi)及對應(yīng)癌旁組織的陽性表達情況,使用Kaplan-Meier(log-rank檢驗)法,COX回歸分析了解患者生存率與CD206的表達高低及各臨床指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果:組織芯片結(jié)果表明CD206在癌內(nèi)的表達水平相較于癌旁顯著為高(P0.05),生存分析結(jié)果表明,癌內(nèi)CD206高表達者較CD206低表達者生存率顯著為低(P=0.008),而癌旁組織中CD206的表達高低與患者生存率無顯著差異(P=0.772)。COX回歸分析提示病理分級(III級,HR=1.449,P=0.043),腫瘤TNM分期(III/IV期,HR=2.117,P=0.013),性別(男性,HR=3.581,P=0.019),甲胎蛋白AFP(200μg/L,HR=2.518,p=0.037)及癌內(nèi)CD206的表達(高表達,HR=2.371,P=0.036)是患者的獨立預(yù)后危險因素。結(jié)論:與TAM密切相關(guān)的甘露糖受體CD206在人原發(fā)性肝細胞肝癌組織中整體呈高表達,各病例對應(yīng)的癌旁組織CD206表達相較癌內(nèi)為低。癌內(nèi)TAM CD206的高表達是與患者預(yù)后密切相關(guān)的獨立危險因素,這為我們后續(xù)干預(yù)CD206治療HCC提供了理論依據(jù)。第二部分誘導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)定細胞表型的腫瘤相關(guān)性巨噬細胞并鑒定目的:使用小鼠RAW264.7巨噬細胞系誘導(dǎo)構(gòu)建穩(wěn)定表型的腫瘤相關(guān)性巨噬細胞,并通過分子生物學(xué)手段進行鑒定。方法:RAW264.7為小鼠單核巨噬細胞,源于小鼠血液系統(tǒng)惡性腫瘤,是腫瘤相關(guān)性巨噬細胞(TAM,或M2)研究中常用細胞系。使用2.5μg/ml的LPS刺激RAW264.7細胞2小時,然后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時,使其向M1型轉(zhuǎn)變;使用10ng/ml的IL-4因子干預(yù)細胞48小時,誘導(dǎo)其向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)變。誘導(dǎo)后的M1及M2型巨噬細胞經(jīng)由流式細胞術(shù)分析F4/80,CD16/32,CD206的表達,PCR分析cd206,arg-1,inos,nf-κb1基因的表達、Western Blot檢測NOS2及Arg-1蛋白的表達差異。結(jié)果:經(jīng)過LPS誘導(dǎo)后的小鼠RAW264.7巨噬細胞高表達i NOS(NOS2),CD16/32,NF-κb1,呈現(xiàn)M1巨噬細胞表型;IL-4作用后的RAW264.7細胞高表達F4/80,CD206及Arg-1,呈現(xiàn)M2表型。結(jié)論:成功誘導(dǎo)建立不同表型的小鼠RAW264.7細胞,其中M2表型的巨噬細胞高表達CD206及Arg-1。這與TAM的特征相符,為后續(xù)實驗打下良好基礎(chǔ)。第三部分氯化釓(Gd Cl3)抑制腫瘤相關(guān)性巨噬細胞CD206的表達作用及相關(guān)機制研究目的:從體外細胞及體內(nèi)動物實驗多角度證實鑭系化合物氯化釓(Gd Cl3)能夠通過影響CD206的表達從而影響TAM功能,從而抑制小鼠肝癌的惡性進展。方法:配制不同濃度的Gd Cl3溶液作用RAW264.7細胞,通過CCK8實驗明確Gd Cl3作用于細胞的IC10濃度;于IC10濃度下的Gd Cl3干預(yù)巨噬細胞,使用流式細胞學(xué),免疫細胞化學(xué),PCR,Western Blot觀察并驗證Gd Cl3對RAW264.7細胞CD206的抑制作用;使用cd206 RNAi抑制M2巨噬細胞CD206的表達,與Gd Cl3干預(yù)后的M2巨噬細胞分別與小鼠Hepa1-6肝癌細胞建立共培養(yǎng)體系,同對照組比較,探索Hepa1-6細胞在侵襲力及腫瘤上皮間質(zhì)化(EMT)水平變化。使用N-亞硝基乙二胺(DEN)誘導(dǎo)BALB/c幼鼠發(fā)生原發(fā)性肝癌,并于腫瘤形成過程中給予小鼠注射Gd Cl3,于不同時間點獲取肝臟組織及血清標(biāo)本,分析Gd Cl3干預(yù)后小鼠肝臟CD206的表達變化,結(jié)合分析小鼠肝癌的生長動力學(xué)參數(shù)(腫瘤大小、體積等)、小鼠肝功指標(biāo)、小鼠生存率等,綜合判斷分析Gd Cl3的抗癌效果及應(yīng)用安全性。結(jié)果:Gd Cl3抑制RAW264.7細胞的IC10濃度為0.069μg/μl。M2型RAW264.7在IC10濃度下的Gd Cl3干預(yù)后,其CD206基因及蛋白表達即可出現(xiàn)顯著下調(diào)。穩(wěn)定下調(diào)CD206的M2型巨噬細胞與小鼠肝癌Hepa1-6細胞共培養(yǎng),與未下調(diào)CD206的M2型巨噬細胞對照組相比較,Hepa1-6細胞侵襲力降低,腫瘤上皮間質(zhì)化程度減弱。DEN成功誘導(dǎo)小鼠HCC,使用Gd Cl3長期干預(yù)小鼠,其CD206表達受到顯著抑制,HCC發(fā)展減緩,小鼠整體生存率上升,Gd Cl3長期應(yīng)用安全。結(jié)論:Gd Cl3能顯著降低M2型RAW264.7細胞及BALB/c小鼠肝癌巨噬細胞CD206的表達,并導(dǎo)致腫瘤惡性程度減低。動物實驗證實長期用藥可行,無顯著生物毒性。我們證實了Gd Cl3能夠成為抗TAM的肝癌潛在治療藥物,值得進一步深入研究及推廣。
[Abstract]:Objective : To investigate the relationship between the expression of CD206 and the expression of CD206 in hepatocellular carcinoma ( HCC ) by using the Kaplan - Meier ( log - rank test ) method . 鎴朚2)鐮旂┒涓父鐢ㄧ粏鑳?yōu)绯?浣跨敤2.5渭g/ml鐨凩PS鍒烘縺RAW264.7緇嗚優(yōu)2灝忔椂,鐒跺悗鎹㈠畬鍏ㄥ煿鍏誨熀緇х畫鍩瑰吇48灝忔椂,浣垮叾鍚慚1鍨嬭漿鍙，

本文編號：1827513