本文選題：hDax1 + 可變剪接體��； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：Dax1(Dosage-sensitive sex reversal-AHC-critical region on the X-chromosome gene1,NR0B1)為孤核受體家族成員,其結(jié)構(gòu)和功能在人和小鼠中保守,是生殖發(fā)育、性別決定及激素生成等重要生理過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控基因。近來(lái)在腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn),Dax1在肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),并與腫瘤的分級(jí)和預(yù)后密切相關(guān)。然而,Dax1在腫瘤中的具體功能和機(jī)制還并不清楚。腫瘤細(xì)胞具有快速增殖、自我更新和多向分化潛能,這些特性同胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell,ESC)非常相似。腫瘤發(fā)生是癌基因異常表達(dá)導(dǎo)致正常細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化的結(jié)果,其過(guò)程與體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripontency stem cell,i PSC)的過(guò)程有諸多類似之處。此外,ESC和iPSC同高惡性度腫瘤樣本具有相似的轉(zhuǎn)錄本特征,并且維持ESC多能性和自我更新的干性基因以及重編程因子,如Oct4、Nanog、Lin28、Klf4等通常在腫瘤中異常表達(dá),并可導(dǎo)致正常細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此,ESC和i PSC中的基因功能對(duì)研究腫瘤發(fā)生的機(jī)制而言,具有十分重要的參考價(jià)值和借鑒意義。蛋白質(zhì)和基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),Dax1是以O(shè)ct4、Nanog為核心的ESC多能性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要成員。我們前期的研究證實(shí),Dax1是維持ESC多能性穩(wěn)定狀態(tài)不可或缺的重要分子,它與Nanog協(xié)同作用,通過(guò)抑制ESC分化而維持其自我更新;在重編程后期,Dax1的表達(dá)是促使i PSC成熟并獲得多能性必要條件。鑒于Dax1與腫瘤的密切關(guān)系,我們推測(cè),Dax1在促細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮重要作用�？勺兗艚邮钦婧松镛D(zhuǎn)錄后調(diào)控的常見(jiàn)方式,通過(guò)對(duì)同一基因pre-m RNA的不同剪接方式,可產(chǎn)生具結(jié)構(gòu)和功能差異的不同剪接體。最新的研究表明,同一個(gè)基因所編碼的不同剪接體的功能相差顯著,幾乎可以認(rèn)為它們是由不同的基因編碼。因此對(duì)基因剪接體類型的分析是研究其功能的前提�；蚪M學(xué)分析顯示,腫瘤發(fā)生過(guò)程中常涉及大規(guī)模的基因剪接方式改變,并產(chǎn)生異常剪接體類型,功能異常剪接體的表達(dá)也是誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要原因。雖然在睪丸、卵巢、胰腺等腫瘤中已發(fā)現(xiàn)Dax1的一個(gè)剪切體,但Dax1是否還存在其它新的剪接體類型以及它們?cè)诩?xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化中的作用還有待闡明。基于上述分析,本研究首先對(duì)人Dax1(hDax1)的不同剪接體類型進(jìn)行鑒定。在此基礎(chǔ)上,分析其與腫瘤的相關(guān)性,并分別研究這些剪接體在誘導(dǎo)正常細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化中的功能,最后對(duì)其可能的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行初步探討。本課題的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.hDax1新剪接體的鑒定1.1通過(guò)套式PCR分析16種人體組織c DNA樣本,并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定,我們發(fā)現(xiàn)人組織中存在8種hDax1剪接體,分別為hDax1L-1413、hDax1L-729、hDax1L-549、hDax1L-453、hDax1A-1203、hDax1A-603、hDax1A-519、hDax1A2-189,各剪接體的mRNA及氨基酸序列均存在較大差異,可翻譯生成具有不同功能結(jié)構(gòu)域的蛋白,在不同類型組織中各hDax1剪接體的表達(dá)和分布特異。Western blots檢測(cè)證實(shí)hDax1剪接體在細(xì)胞中存在內(nèi)源性表達(dá)。1.2間接免疫熒光染色結(jié)果顯示hDax1各剪接體亞細(xì)胞定位不同,且具有細(xì)胞特異性;雙熒光素酶報(bào)告載體分析和ChIP-q PCR檢測(cè)顯示hDax1各剪接體具有不同的轉(zhuǎn)錄抑制活性及DNA結(jié)合能力;蛋白質(zhì)免疫共沉淀分析顯示不同hDax1剪接體的蛋白結(jié)合能力也存在差異。提示hDax1各剪接體具有不同功能。2.hDax1剪接體與腫瘤的相關(guān)性分析2.1通過(guò)檢測(cè)不同類型腫瘤細(xì)胞系中hDax1的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞系至少存在hDax1L-1413、hDax1L-729、hDax1A-1203、hDax1A-519四種剪接體類型,而在不同類型腫瘤細(xì)胞系中,各剪接體表達(dá)分布不同。2.2我們利用GEO公共數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤樣本的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù),分析不同來(lái)源正常和腫瘤組織中hDax1表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)與正常組織相比,hDax1在肺癌、黑色素瘤等多種類型腫瘤中表達(dá)上調(diào),且與肺癌和黑色素瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。隨后我們對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA-seq數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示hDax1各剪接體在不同類型腫瘤組織中的分布不同。進(jìn)一步對(duì)肺癌和黑色素瘤臨床樣本中hDax1剪接體的檢測(cè)結(jié)果顯示,在同類型腫瘤不同樣本間,hDax1剪接體的表達(dá)分布也存在差異。提示不同hDax1剪接體可能參與不同類型腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程。2.3利用單細(xì)胞水平RT-PCR檢測(cè),我們分析了同一腫瘤細(xì)胞系的單個(gè)細(xì)胞中hDax1表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)hDax1各剪接體也存在異質(zhì)性表達(dá)。提示不同hDax1剪接體在細(xì)胞中可能發(fā)揮不同功能。3.hDax1剪接體在誘導(dǎo)正常細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化中的功能分析利用經(jīng)典轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)模型NIH3T3構(gòu)建hDax1各剪接體的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,通過(guò)對(duì)細(xì)胞形態(tài)、非錨定生長(zhǎng)、增殖能力及成瘤性等細(xì)胞轉(zhuǎn)化表型的分析,我們發(fā)現(xiàn)剪接體hDax1L-1413、hDax1A-1203、hDax1A-519、hDax1A2-189過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)NIH3T3出現(xiàn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài),獲得非錨定生長(zhǎng)能力,且具有裸鼠體內(nèi)成瘤性。其中h DaxA-1203/NIH3T3和hDax1A2-189/NIH3T3細(xì)胞形成腫瘤體積較大,而hDax1L-1413/NIH3T3和hDax1A2-189/NIH3T3細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤起始能力,提示它們誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的惡性程度不同。增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這四種剪接體無(wú)促增殖能力,表明它們誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化為增殖非依賴性的。而剪接體hDax1L-729、hDax1L-549、hDax1L-453、hDax1A-603無(wú)明顯促轉(zhuǎn)化能力。4.hDax1剪接體誘導(dǎo)細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化的機(jī)制分析利用基因表達(dá)譜芯片我們對(duì)hDax1各剪接體誘導(dǎo)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制進(jìn)行初步分析,發(fā)現(xiàn)剪接體hDax1L-1413、hDax1A-1203、hDax1A-519、hDax1A2-189促細(xì)胞轉(zhuǎn)化機(jī)制不同,其中hDax1L-1413主要通過(guò)活化小GTPase介導(dǎo)的信號(hào)通路;hDax1A-1203則主要引起HIF-1、SHH及MAPK通路失調(diào);hDax1A-519主要影響HIF-1通路;而hDax1A2-189主要影響HIF-1、SHH及WNT通路。隨后的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)各細(xì)胞中以上通路相關(guān)分子的表達(dá)變化與芯片分析結(jié)果一致。綜上所述,本研究分析并鑒定了hDax1的新剪接體,發(fā)現(xiàn)它們具有不同的結(jié)構(gòu)及功能。在不同類型腫瘤組織和細(xì)胞中,hDax1各剪接體表達(dá)分布存在差異。通過(guò)對(duì)hDax1各剪接體在誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的功能研究,我們發(fā)現(xiàn)hDax1可作為一個(gè)新的癌基因,促使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化并獲得致瘤性。不同hDax1剪接體具有不同的促細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力及調(diào)控機(jī)制,提示在不同類型腫瘤發(fā)生中,hDax1各剪接體可能發(fā)揮了不同功能。新剪接體的發(fā)現(xiàn)讓我們對(duì)hDax1分子有了全新的認(rèn)識(shí),而hDax1各剪接體在誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的功能和機(jī)制分析則可為進(jìn)一步揭示不同類型腫瘤的發(fā)生機(jī)理提供新線索,并為腫瘤的特異性診斷和治療提供新的靶標(biāo)。
[Abstract]:In recent studies , Dax1 is an important element in the regulation and regulation of tumor . The expression of Dax1 is a key element in the regulation of tumor . In this study , we found that the expression of hDax1 splice body in human tissue is different from that of hDax1 splice . The expression profiles of hDax1 - 1413 , hDax1A - 1203 , hDax1A - 519 , hDax1A - 1203 , hDax1A - 519 , hDax1A - 189 and hDax1A - 519 were analyzed .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2

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本文編號(hào)：1824032