本文選題：食管鱗癌 + STAT3蛋白　； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的食管癌位于全球癌癥死亡率中第六,其中,我國的中北部是食管癌高發(fā)地區(qū)之一。90%以上的食管癌類型為鱗癌,雖然腫瘤的治療技術(shù)在不斷地提高,但食管鱗癌的五年生存率仍低于30%。食管鱗癌的發(fā)病原因多種多樣,它的發(fā)生機制也是錯綜復(fù)雜,有許多研究發(fā)現(xiàn)它與多種信號通路的激活有關(guān),但其具體的機制現(xiàn)在尚未研究清楚。近年來研究表明,腫瘤的發(fā)生與慢性感染和炎癥有密切關(guān)系。因此,研究學(xué)者通過不斷尋求設(shè)計新的方法了解食管鱗癌的分子機制,從而提高其臨床治療效果和預(yù)后,以及改善耐藥性。目前,腫瘤的治療方法包括手術(shù)、化療、放射治療以及生物治療,可是這幾種方法都存在一定的局限性,隨著人們對腫瘤病因以及發(fā)病機制的不斷深入了解,許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤是可以預(yù)防的。目前,化學(xué)預(yù)防在腫瘤中的應(yīng)用逐漸受到廣泛的關(guān)注,它是指利用天然的或者合成的藥物提前干預(yù)腫瘤的進展,并且化學(xué)預(yù)防手段可以阻斷腫瘤中多個信號通路的激活。姜黃素(Curcumin)是姜黃科植物根莖中的天然提取物,它不僅具有抗氧化、抗炎的功效,還能夠調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK等信號通路,從而抑制腫瘤細胞的增殖和促進腫瘤細胞的凋亡。近年來,有許多研究發(fā)現(xiàn)JAK-STAT信號通路在多種腫瘤中扮演著重要角色,STATs可以被多種細胞因子、生長因子和一些激素所激活,STAT3屬于STATs蛋白家族中的一員。在正常細胞中,STAT3的激活是短暫且可逆的,目前,已有許多研究發(fā)現(xiàn),在許多惡性腫瘤中檢測到STAT3的持續(xù)激活,活化的STAT3可以促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成,干擾腫瘤細胞凋亡和抗腫瘤免疫反應(yīng),也與腫瘤的預(yù)后有關(guān)等。因此,阻斷STAT3的功能有望為腫瘤靶向治療和化學(xué)預(yù)防提供一個新的重要方向。本文通過兩部分來研究姜黃素在炎癥誘導(dǎo)的食管鱗癌中的化學(xué)預(yù)防作用,利用si RNA下調(diào)食管鱗癌細胞中STAT3的表達,探究STAT3在食管鱗癌細胞生長中的作用,體外選取EC9706和TE13食管鱗癌細胞系為實驗對象,評價姜黃素能否通過STAT3信號通路對食管鱗癌細胞的增殖、克隆形成能力、凋亡及周期產(chǎn)生影響;IL-6是STAT3的一個激活因子,我們用IL-6作用于EC9706和TE13細胞并聯(lián)合應(yīng)用姜黃素,評價姜黃素是否可以阻斷因IL-6刺激以后的STAT3的組成型激活;體內(nèi)建立人源性食管鱗癌移植瘤模型(PDX模型),評價姜黃素在體內(nèi)對STAT3不同激活狀態(tài)的腫瘤的治療效果,為STAT3作為食管鱗癌的分子治療靶點,以及姜黃素能否成為炎癥誘導(dǎo)的食管鱗癌的化學(xué)預(yù)防藥物提供理論依據(jù)。第一部分姜黃素通過下調(diào)STAT3的活性從而抑制食管鱗癌細胞的增殖及促進凋亡方法1.利用STAT3 si RNA作用于EC9706細胞48h,檢測下調(diào)STAT3后細胞周期及凋亡情況。2.CCK-8細胞毒性實驗:不同濃度姜黃素(0、25、50、100μM)分別作用于食管鱗癌細胞EC9706和TE13 24和48h,測定食管鱗細胞的吸光度值,從而計算出細胞的生存率,選取細胞生存率為80%左右的藥物濃度為細胞增殖實驗的最大藥物濃度。3.CCK-8細胞增殖實驗:不同濃度姜黃素(0、4、8、12、16μM)分別作用于食管鱗癌細胞EC9706和TE13不同時間(0、24、48、72、96h),測定食管鱗癌細胞在姜黃素作用下的吸光度值,評價姜黃素對細胞增殖能力的影響。4.軟瓊脂克隆形成實驗:評價不同濃度姜黃素(0、4、8、12、16μM)對食管鱗癌細胞克隆形成能力的影響。5.細胞凋亡和周期實驗:用Annexin V-FITC、Hoechst33342及DAPI染色,檢測不同濃度姜黃素(0、4、8、12、16μM)對食管鱗癌細胞EC9706和TE13凋亡及周期的影響6.Western blotting檢測姜黃素作用于食管鱗癌細胞EC9706和TE13后STAT3信號通路的變化;同樣,利用該方法檢測姜黃素對IL-6刺激EC9706和TE13細胞后STAT3信號通路的影響。結(jié)果1.結(jié)果顯示,si RNA-1878和si RNA-1272轉(zhuǎn)染EC9706細胞后,與對照組相比,凋亡的細胞以及S期細胞明顯增多。2.不同濃度姜黃素(0、25、50、100μM)分別作用于EC9706和TE13細胞24、48h后,繪制細胞毒性結(jié)果曲線圖,結(jié)果顯示,細胞生存率為80%左右的藥物濃度為20μM。3.不同濃度姜黃素(0、4、8、12、16μM)分別作用于EC9706和TE13細胞0、24、48、72、96h后,結(jié)果顯示,姜黃素能夠抑制食管鱗癌細胞的增殖,且濃度越大,細胞增殖的能力越小。4.軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果表明,姜黃素可以抑制EC9706細胞的克隆形成,且姜黃素濃度越大,克隆數(shù)量越少。5.細胞凋亡和周期結(jié)果顯示,姜黃素可以誘導(dǎo)EC9706和TE13細胞的凋亡,濃度越高,誘導(dǎo)作用越明顯;姜黃素可以阻滯細胞周期的進展,使S期細胞數(shù)量明顯增多,呈濃度依賴性。6.Western blotting結(jié)果顯示,姜黃素可以抑制EC9706和TE13細胞中p-STAT3的表達,同時還能夠抑制i NOS和p-NF-κB的表達,同時,姜黃素也可以抑制由IL-6引起的p-STAT3的活化。第二部分姜黃素通過下調(diào)STAT3的活性從而抑制人源性食管鱗癌移植瘤(PDX)的生長方法1.選取多種人食管鱗癌組織,提取蛋白后用Western blotting檢測其p-STAT3的表達情況。2.選取組織EG37(p-STAT3高表達)和EG2(p-STAT3低表達),構(gòu)建PDX模型,利用該模型評價姜黃素的抗癌和預(yù)防效果。3.治療結(jié)束后,將各組瘤體剝出,提取蛋白后用Western blotting檢測瘤體中p-STAT3及其調(diào)節(jié)的相關(guān)蛋白的表達情況。4.采用免疫組織化學(xué)法檢測各組瘤體中STAT3信號通路以及Caspase-3的表達水平。5.用HE染色觀察各組瘤體中細胞的分化、壞死情況。6.TUNEL法觀察經(jīng)姜黃素治療后,組織細胞的凋亡情況。結(jié)果1.在EG37和EG2 PDX模型中,與對照組相比,姜黃素可以抑制腫瘤的生長,預(yù)防組比治療組的抑制效果更加明顯,且在這兩個模型中,姜黃素的抗癌效果在STAT3高活化EG37組中更加顯著。2.Western blotting結(jié)果顯示,在姜黃素治療組和預(yù)防組中,p-STAT3、i NOS、p-NF-κB和Cox2的表達水平降低。3.免疫組化結(jié)果顯示,姜黃素治療組和預(yù)防組中,p-STAT3和Cox2的表達水平降低,且Caspase-3的表達水平升高。4.TUNEL結(jié)果顯示,在姜黃素治療組和預(yù)防組中,瘤體組織細胞的凋亡數(shù)量明顯增多。結(jié)論1.體外研究表明,姜黃素能夠阻斷食管鱗癌細胞中STAT3的活化,抑制IL-6激活的STAT3,以及下調(diào)p-NF-κB和i NOS的表達,從而抑制細胞的增殖、克隆形成,誘導(dǎo)細胞凋亡和阻滯細胞周期。2.人食管鱗癌PDX模型體內(nèi)結(jié)果顯示,姜黃素通過阻斷STAT3的組成型激活從而抑制腫瘤的生長,且可以促進細胞的凋亡。3.體內(nèi)外實驗結(jié)果表明,姜黃素有望成為炎癥誘導(dǎo)的食管鱗癌化學(xué)預(yù)防中的一種有效藥物。
[Abstract]:Objective : To study the effect of curcumin on the growth of esophageal squamous cell carcinoma . The effects of curcumin ( 0 , 4 , 8 , 12 , 16 渭M ) on the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma cells ( EC9706 and TE13 ) were investigated . 3 . The results showed that curcumin could block the activation , inhibit IL - 6 activation and downregulate the expression of p - NF - 魏B and i

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

【參考文獻】

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本文編號：1809602