本文選題：跨膜 + 氨酸��； 參考：《山東大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是我國以及亞洲最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)生率與死亡率均居前列。肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究,對(duì)肝癌的臨床早期診斷、治療、降低術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移以改善肝癌患者預(yù)后具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。研究表明,血管生成的程度與腫瘤的分期密切相關(guān),抑制腫瘤血管生成在一定程度上可抑制腫瘤的進(jìn)展�？缒そz氨酸蛋白酶4(transmembrane serine protease 4,TMPRSS4)是 Ⅱ 型跨膜絲氨酸蛋白酶(type II transmembrane serine protease,TTSPs)家族中的重要一員,具有較為典型的絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征,研究已證實(shí)其可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。前期研究表明,TMPRSS4可通過誘導(dǎo)肝癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移,但其對(duì)肝癌血管生成的影響及相關(guān)機(jī)制目前尚不清楚。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索TMPRSS4誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的血管生成的作用及其機(jī)制,為防治肝細(xì)胞癌提供新的治療靶點(diǎn)與理論支持。方法:(1)采用人肝癌細(xì)胞株MHCC97H與HuH-7細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn):本實(shí)驗(yàn)采用肝癌細(xì)胞株MHCC97H與HuH-7細(xì)胞系。首先轉(zhuǎn)染TMPRSS4過表達(dá)的慢病毒,以構(gòu)建TMPRSS4上調(diào)的肝癌細(xì)胞株。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,我們將細(xì)胞分為:肝癌細(xì)胞的對(duì)照(control)組、空白載體轉(zhuǎn)染(Lv-GFP)組和 TMPRSS4 過表達(dá)(Lv-TMPRSS4)組。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立后,將兩種細(xì)胞株的control組、Lv-TMPRSS4肝癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下成瘤。(2)觀察指標(biāo)及方法:體外培養(yǎng)上述肝癌細(xì)胞株,Matrigel膠成管實(shí)驗(yàn)檢測不同TMPRSS4表達(dá)肝癌細(xì)胞株培養(yǎng)48h的細(xì)胞上清液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(EA.hy926細(xì)胞)成管能力的影響;對(duì)皮下種瘤的腫瘤組織進(jìn)行CD34染色以判斷體內(nèi)條件下TMPRSS4作用于血管生成的能力;PCR檢測不同TMPRSS4表達(dá)的肝癌細(xì)胞株的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)量,Western Blot檢測哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)以及磷酸化mTOR的表達(dá)量。結(jié)果:(1)TMPRSS4過表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建TMPRSS4過表達(dá)慢病毒載體、空白載體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株MHCC97H、HuH-7細(xì)胞株48h后,在熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染空白載體的(Lv-GFP)及TMPRSS4過表達(dá)慢病毒載體(Lv-TMPRSS4)的肝癌細(xì)胞均帶有綠色熒光,未轉(zhuǎn)染慢病毒載體的對(duì)照組細(xì)胞在熒光顯微鏡下未見綠色熒光。qRT-PCR、Western Blot結(jié)果顯示慢病毒載體轉(zhuǎn)染48h后,轉(zhuǎn)染TMPRSS4過表達(dá)載體的肝癌細(xì)胞TMPRSS4的表達(dá)水平顯著增高。說明人肝癌TMPRSS4過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建成功。(2)TMPRSS4促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管擬態(tài)形成Matrigel膠成管實(shí)驗(yàn)顯示,加入TMPRSS4過表達(dá)肝癌細(xì)胞細(xì)胞上清培養(yǎng)液后,人臍靜脈細(xì)胞在基質(zhì)膠中的成管能力顯著高于對(duì)照組及空白載體組。這表明TMPRSS4分泌了促腫瘤血管生成因子,從而促進(jìn)了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在基質(zhì)膠中的血管擬態(tài)形成。(3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TMPRSS4可誘導(dǎo)肝癌血管生成免疫組化結(jié)果顯示,TMPRSS4過表達(dá)的HuH-7細(xì)胞所形成的腫瘤組織中TMPRSS4表達(dá)顯著增強(qiáng)。CD34結(jié)果顯示TMPRSS4過表達(dá)組腫瘤組織的微血管密度(microvesseldenisity,MVD)顯著高于對(duì)照組。這說明在體內(nèi)條件下,TMPRSS4可促進(jìn)肝細(xì)胞癌微血管形成。(4)TMPRSS4可促進(jìn)肝癌細(xì)胞分泌VEGFqRT-PCR結(jié)果顯示:Lv-TMPRSS4過表達(dá)組的VEGF表達(dá)量顯著高于對(duì)照組及轉(zhuǎn)染空白載體組。(5)TMPRSS4可促進(jìn)肝癌細(xì)胞內(nèi)的p-mTOR表達(dá)Western Blot結(jié)果顯示,Lv-TMPRSS4過表達(dá)組的p-mTOR表達(dá)量顯著高于對(duì)照組及轉(zhuǎn)染空白載體組,總mTOR表達(dá)量無顯著改變。結(jié)論:(1)跨膜絲氨酸蛋白酶4可在體內(nèi)、體外條件下促進(jìn)肝細(xì)胞癌的血管生成。(2)TMPRSS4可顯著上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)。(3)TMPRSS4可以激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR),使磷酸化的(p-mTOR)表達(dá)量顯著上調(diào)。
[Abstract]:Objective : hepatocellular carcinoma ( HCC ) is one of the most common malignant tumors in China , and its occurrence rate and mortality rate are all in the forefront . The results were as follows : ( 1 ) The expression of MHCC97H and MHCC97H was significantly higher than that of control group . Conclusion : ( 1 ) Transmembrane serine proteinase 4 can increase the expression of vascular endothelial growth factor ( VEGF ) in vivo and in vitro .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1804119