本文選題：HSS + 細(xì)胞分化　； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：急性白血病(acute leukemia, AL)是一種獲得性造血干細(xì)胞異常造成的惡性增殖性疾病,目前發(fā)病率約為2.76/10萬,是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。盡管聯(lián)合化療、免疫治療如CAR-T、干細(xì)胞移植及靶向藥物治療等治療策略的進(jìn)展,除了70～80%的兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)能夠治愈,其他類型AL長期無病生存率(Disease-Free Survival, DFS)僅為30-40%,遠(yuǎn)期預(yù)后差。因此針對白血病治療的新的藥物、新的治療手段越來越重要。近年來有人提出了腫瘤的誘導(dǎo)分化治療。它的理論基礎(chǔ)是引起細(xì)胞分化受抑的相關(guān)基因在一定條件下是可逆的,腫瘤的子代細(xì)胞,在一定條件和環(huán)境下也可被誘導(dǎo)而再次向成熟細(xì)胞分化[2]。它改變了既往的治療思路,區(qū)別于手術(shù)切除或以放射線、細(xì)胞毒藥物等直接殺傷腫瘤細(xì)胞,而是逆轉(zhuǎn)其分化受抑,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步成熟分化為正常細(xì)胞或接近正常細(xì)胞。在此理論指導(dǎo)下全反式維甲酸(ATRA)和三氧化二砷(AS2O3)相繼應(yīng)用于臨床治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)并取得了突破性進(jìn)展,是目前誘導(dǎo)分化治療惡性疾病的第一個(gè)成功模型,也是研究和應(yīng)用最多的。但是,隨著臨床應(yīng)用病例的不斷擴(kuò)大,二者都存在療效的個(gè)體差異、耐藥性、復(fù)發(fā)率和變異綜合癥等其他不同程度的毒副作用,甚至部分患者治療失敗。到目前為止,ATRA及AS2O3主要對APL有效,對非M3型急性髓系白血病(AML)或其他腫瘤治療無效,或效果不突出。其他常見的誘導(dǎo)分化劑如維生素D3、干擾素及細(xì)胞因子類等由于自身的各種局限性阻止了在臨床腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用。因此,迫切需要尋找新的毒性小、選擇性強(qiáng)的誘導(dǎo)分化劑來滿足臨床需要。海洋中藥是中藥的重要組成部分,是指來源于海洋中的用于預(yù)防和治療疾病的天然藥物,體外試驗(yàn)證實(shí)有些海洋中藥有抗腫瘤及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化的作用。泥蚶的提取物(Tegillarca granosa)作為一種傳統(tǒng)海洋中藥用于治療腫瘤性疾病及其他慢性疾病已有1000多年的歷史,它富含多肽類及維生素B12,具有抗腫瘤、抗病毒和細(xì)菌、免疫調(diào)節(jié)等多方面的作用,且長期的食用證明其無毒副作用。海生素(haishengsu, HSS)是近年來應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)從海洋生物泥蚶軟體中提取出的一種小分子糖多肽類物質(zhì),體外試驗(yàn)證實(shí)對腎癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞有明顯的抑制增殖作用,并可通過bcl/bax、 Fas/FasL等通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,臨床試驗(yàn)也證實(shí)HSS可顯著增強(qiáng)白血病患者的化療的敏感性。然而這些研究大多集中在實(shí)體瘤方面或是本身的抑制腫瘤增殖、增強(qiáng)化療敏感性方面,對于HSS是否可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞成熟分化及機(jī)制尚未有研究報(bào)道到。目前為止,對于HSS對HL-60細(xì)胞是否存在誘導(dǎo)分化作用及具體機(jī)制,還沒有系統(tǒng)的說明。本研究以HL-60細(xì)胞為體外分化誘導(dǎo)模型,觀察HSS對HL-60細(xì)胞增殖及分化成熟的影響,并與最常用的誘導(dǎo)分化劑ATRA和AS203的作用進(jìn)行比較,并初步探討了其作用機(jī)制,以其希望尋找一種新的誘導(dǎo)分化和凋亡劑。目的：1.研究HSS對HL-60細(xì)胞的增殖的影響。2.研究HSS對HL-60細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)分化的作用,并探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。3.闡明HSS對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化及凋亡作用可能的機(jī)制。方法：1.研究HSS對HL-60細(xì)胞的增殖的影響。1.1分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組、空白對照組及陰性對照組：各實(shí)驗(yàn)組HSS濃度分別為0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L;空白對照組只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞,陰性對照組只加細(xì)胞不加藥物。1.2分別培養(yǎng)12h、24h、48h、72h后四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測各實(shí)驗(yàn)組及空白對照組、陰性對照組吸光度值。1.3根據(jù)吸光度值計(jì)算增殖抑制率。1.4將不同的HSS濃度及相對應(yīng)的增殖抑制率輸入Graphpad Prism 5軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。2.研究HSS對HL-60細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)分化的作用,并同臨床最常用的誘導(dǎo)分化劑ATRA、AS2O3在細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)、表面分化抗原、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分布等方面進(jìn)行比較,探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。2.1分別設(shè)立HSS 100mg/L組、ATRA 5umol/L組、AS2O35umol/L組及對照組,培養(yǎng)72小時(shí)。2.2細(xì)胞增殖：MTT法檢測培養(yǎng)前后各實(shí)驗(yàn)組及對照組吸光度值,并根據(jù)吸光度值計(jì)算HL-60細(xì)胞增殖抑制率。2.3細(xì)胞形態(tài)：吉姆薩染色觀察實(shí)驗(yàn)前后細(xì)胞大小、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞核改變等2.4細(xì)胞表面分化抗原：利用FTCT標(biāo)記的鼠抗人CD11b單抗,PE標(biāo)記的CD 15單抗,流式細(xì)胞術(shù)分析HL-60細(xì)胞表面分化成熟的標(biāo)志CD11b、CD15的表達(dá)的變化。2.5細(xì)胞凋亡：采用Annexin V/PI雙染法,流式細(xì)胞檢測各組HL-60細(xì)胞凋亡。2.6細(xì)胞周期分布：利用碘化丙啶(PI)染色后,流式細(xì)胞術(shù)檢測各組HL-60細(xì)胞細(xì)胞周期的分布。3.HSS對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化及凋亡作用可能的機(jī)制3.1分別設(shè)立HSS100mg/L組、ATRA5umol/L組、AS2O35umol/L組及對照組,培養(yǎng)72小時(shí).3.2RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)前后各組HL-60細(xì)胞中用bcl-2/bax、mpo基因的表達(dá),主要包括細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA、PCR反應(yīng)擴(kuò)增cDNA、PCR產(chǎn)物檢測。3.3 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中bcl-2、bax蛋白的表達(dá)。3.4對各組HL-60細(xì)胞bcl-2/bax基因、蛋白表達(dá)的變化進(jìn)行比較,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：1.HSS對HL-60細(xì)胞增殖的影響HSS (0.1mg/L, 1mg/L, 10mg/L) 12h、24h、48h、72h各時(shí)間點(diǎn)吸光度值與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 0.05); HSS (100mg/L,1000 mg/L) 12h吸光度值與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),24h、48h、72h各時(shí)間點(diǎn)吸光度值與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),與0.1、1、10 mg/L組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；在100、1000 mg/L濃度下12h、24h、48h、72h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。經(jīng)Graphpad Prism 5軟件分析72小時(shí)HSS作用HL-60細(xì)胞的IC50為：40mg/L。2.HSS對HL-60細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)分化的作用及同ATRA、AS2O3的作用進(jìn)行比較2.1對HL-60細(xì)胞增殖的影響：HSS 100mg/L. ATRA 5umol/L、AS2O3 5umol/L均對HL-60細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用并呈時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。HSS組24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)增殖抑制率分別為25.23±5.13%、39.13±3.14%、70.45±8.20%；ATRA組分別為：4.56±3.31%23.20±4.32%、44.22±6.26%；AS203組分別為：4.25±3.82%、36.80±2.45%、73.62±7.28%。24小時(shí)時(shí)HSS組的增殖抑制率高于ATRA組、AS203組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。48小時(shí)、72小時(shí)時(shí)高于ATRA組(P0.05),與AS203組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.2光鏡下細(xì)胞形態(tài)變化：對照組HL-60細(xì)胞體積大,大多為圓形或不規(guī)則橢圓形,細(xì)胞核大而圓,核仁清晰可見,染色質(zhì)分散,胞漿嗜堿深染,細(xì)胞核和細(xì)胞漿比例增大；ATRA組HL-60細(xì)胞體積明顯縮小,細(xì)胞核凹陷縮小,并轉(zhuǎn)變?yōu)闂U狀核、腎形核甚至出現(xiàn)分葉核。核仁數(shù)量減少,染色質(zhì)致密變粗。細(xì)胞核和細(xì)胞漿比例縮小,部分細(xì)胞發(fā)生凋亡；AS203組HL-60細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞核凹陷縮小,部分細(xì)胞核斷裂成數(shù)個(gè)大小不等的圓形顆粒,染色質(zhì)嗜堿性增強(qiáng),部分細(xì)胞形成凋亡小體。HSS組HL-60細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為細(xì)胞體積明顯縮小,細(xì)胞核縮小內(nèi)陷,核仁數(shù)量減少,細(xì)胞核形狀不規(guī)則,出現(xiàn)了多葉核等,細(xì)胞漿增多,核漿比例縮小,染色質(zhì)變粗致密。2.3細(xì)胞表面分化抗原的變化：HSS 100mg/L、ATRA 5umol/L、AS2O3 5umol/L作用HL-60細(xì)胞72小時(shí)后,細(xì)胞表面CD11b陽性率分別為63.50±8.28%、 70.65±7.20%、18.30±2.27%,對照組為6.42±4.04%,各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); HSS組與ATRA組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),與AS203組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。CD 15在HSS組、ATRA組、AS203組和對照組分別為93.24±8.06%、93.58±6.28%、91.28±7.27%、96.50±7.24%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.4細(xì)胞凋亡率的變化：HSS 100mg/L, ATRA 5umol/L, AS2O35umol/L作用HL-60細(xì)胞72小時(shí)后,凋亡率分別為：38.90±3.24%、40.34±4.25%、38.18±7.20%,對照組為5.10±4.20%。各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。HSS組與 ATRA、AS2O3組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.5細(xì)胞周期分布：經(jīng)HSS 100mg/L作用HL-60細(xì)胞72小時(shí)后G0/G 1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例分別為：67.8±5.2%、26.5±3.8%5.7±2.0%,對照組為40.1±4.0%、50.2±1.4%、9.7±2.6%。HSS組大部分細(xì)胞停留在G0/G 1期,S期細(xì)胞明顯減少,G2/M期細(xì)胞相對減少。HSS組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ATRA組分別為：76.0±3.9%、18.7±2.3%、5.3±1.2%, As203組分別為72.9±2.7%、20.1±1.9%、7.0±1.5%；100mg/LHSS組與ATRA組比較,G0/G1期細(xì)胞所占比例低(P0.05),與AS2O3組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3.HSS對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化及凋亡作用可能的機(jī)制3.1經(jīng)HSS100mg/L作用HL-60細(xì)胞72小時(shí)后,HSS組HL-60細(xì)胞bcl-2基因mRNA相對表達(dá)量為0.68±0.06,對照組為0.89±0.12,HSS組bcl-2基因表達(dá)減弱,與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；AS203組、ATRA組bcl-2基因表達(dá)也減弱,分別為0.81±0.16和0.73±0.29,但與對照組比較差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05), HSS組同AS203組、ATRA組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); HSS組、AS203組、ATRA組bax基因mRNA相對表達(dá)量分別為：0.89±0.15,0.50±0.05,0.89±0.06,對照組為0.18±0.07；各實(shí)驗(yàn)組與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 HSS組同ATRA組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但同AS203組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),要高于AS203組。3.2 HSS組、AS203組、ATRA組mpo基因]mRNA相對表達(dá)量分別為：0.44±0.14、0.86±0.08、0.83±0.15,對照組為0.95±0.17；各實(shí)驗(yàn)組mpo基因表達(dá)減弱,與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。最明顯的是HSS組,其次為ATRA組和AS2O3組；HSS組與ATRA組、AS2O3組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.3 Western blotting結(jié)果顯示,HSS組、ATRA組、AS2O3組bcl-2蛋白表達(dá)量分別為：0.45±0.09、0.36±0.11、0.39±0.15,對照組為0.76±0.08,各實(shí)驗(yàn)組bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于對照組(P0.05)。HSS組、ATRA組、AS2O3組bax蛋白表達(dá)量分別為：0.70±0.12、0.74±0.10、0.69±0.09,對照組為0.35±0.10,各實(shí)驗(yàn)組bax蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P0.05)。 bcl-2蛋白和bax蛋白表達(dá)在各實(shí)驗(yàn)組之間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；結(jié)論：1.低濃度HSS對HL-60細(xì)胞無增殖抑制作用；較高濃度HSS24小時(shí)后對HL-60細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用并呈時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系。2.HSS對HL-60細(xì)胞還有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化的作用。其誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡及分化的能力在某些方面同ATRA、AS203類似,甚至優(yōu)于ATRA、AS203；3.HSS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡及分化的機(jī)制可能涉及bcl-2／bax基因。4.HSS在有可能成為新的白血病誘導(dǎo)分化劑而應(yīng)用于臨床。當(dāng)然這也需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)特別是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1799260