本文選題：FLI1環(huán)狀RNA + 小細胞肺癌��； 參考：《吉林大學》2017年博士論文

【摘要】：肺癌是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤,在我國肺癌已成為發(fā)病率及死亡率排名第一的惡性腫瘤,其中小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)在肺癌中所占的比例約為15%。小細胞肺癌具有高侵襲性、高復發(fā)性及生長迅速的生物學特點,大多數(shù)小細胞肺癌診斷時已為廣泛期,局限期僅占1/3,局限期和廣泛期小細胞肺癌5年生存率僅為10%和2%。近40年來,小細胞肺癌的治療并未取得明顯的進展,目前鉑類聯(lián)合依托泊苷的化療方案仍是小細胞肺癌的一線治療選擇,大多數(shù)患者在治療后1年內(nèi)復發(fā)或進展,這些患者進一步治療后的中位生存時間只有4-5個月。如何提高小細胞肺癌治療效果是人類健康研究亟待解決的重要研究課題。主要由于小細胞肺癌分子機制的研究尚不清晰。因此明確小細胞肺癌疾病發(fā)生及發(fā)展的分子機制是目前小細胞肺癌研究的重點。我們從癌基因異常表達分析入手,明確小細胞肺癌的分子病理機制,以探索更加合適的靶點,將可能為小細胞肺癌的治療帶來突破性進展。研究背景:弗里德白血病病毒插入位點1(Friend leukemia virus integration 1,FLI1)屬于Ets(E26 transformation-specific)家族的轉錄因子,最早由Ben-David等在Friend病毒誘導的小鼠紅白血病細胞中發(fā)現(xiàn)。通常情況下,FLI1主要存在于造血系統(tǒng)、血管內(nèi)皮細胞及纖維母細胞中,此后通過研究證實FLI1可在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮始動基因的作用。促癌基因FLI1可以通過特異性序列結合多種基因的啟動子或增強子從而調(diào)控靶基因的轉錄活性,例如Bcl-2,而發(fā)揮促癌作用。近年來,隨著對FLI1研究的深入,越來越多的研究顯示FLI1在尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma,EWS)、惡性黑色素瘤(metastatic melanomas)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)、轉移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)等多種實體腫瘤中亦存在異常高表達,且與上述腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。目前我們研究團隊已證實FLI1在小細胞肺癌組織中異常高表達,且與小細胞肺癌細胞的增殖、凋亡及克隆形成能力等惡性表型密切相關。近年來,隨著RNA二代測序的進展,circRNA這一特殊的非編碼RNA分子受到越來越多研究者們的關注。與線性RNA不同,circRNA分子呈封閉環(huán)狀結構,不受RNA外切酶影響,表達穩(wěn)定且不易降解。最近研究報道circRNA分子富含miRNA結合位點,在細胞中起到miRNA海綿的作用,能阻斷或降低miRNA對基因的抑制作用,從而調(diào)控靶基因的表達;同時還具有調(diào)控基因轉錄的潛能。我們通過前期數(shù)據(jù)庫調(diào)研發(fā)現(xiàn)FLI1基因存在6種circRNAs形式,進一步通過對不同種肺癌細胞系及肺癌組織的檢測發(fā)現(xiàn)有兩種FLI1環(huán)狀RNA(circFLI1)形式,即由FLI1外顯子234形成的circRNA(circFLI1 E2-4)及由FLI1外顯子2345形成的circRNA(circFLI1 E2-5),在小細胞肺癌組織及細胞系中的表達豐度顯著高于非小細胞肺癌,但其在小細胞肺癌細胞中是否存在一定功能及其具體作用機制如何仍需進一步研究證實。研究目的:1.檢測circFLI1在不同肺癌細胞及組織中的表達豐度。2.分析circFLI1與小細胞肺癌臨床特征的相關性。3.全面評估circFLI1在小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的生物學功能。4.探討circFLI1促癌的分子機制,揭示circFLI1參與調(diào)控的信號通路以及下游靶基因。研究方法:通過實時定量熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-PCR)及熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測的方法檢測circFLI1在不同肺癌細胞及組織中的表達豐度,特別是在小細胞肺癌中的表達情況,統(tǒng)計學方法分析circFLI1與小細胞肺癌臨床特征的相關性。通過sh RNA穩(wěn)定干涉circFLI1的表達,并應用MTT、細胞計數(shù)法、流式細胞儀、Annexin V/7-AAD染色、Transwell和平板克隆形成實驗評估circFLI1對細胞增殖、細胞周期、凋亡、遷移及克隆形成能力的影響。并通過裸鼠肺轉移模型對circFLI1s在腫瘤轉移中的作用進行進一步的體內(nèi)實驗驗證。應用熒光素酶活性測試、western blot、RT-PCR、FISH檢測及用逆轉錄相關捕獲法(reverse transcription associated trap assay,RAT)等方法對分子機制進行探討。研究結果:1.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5在小細胞肺癌細胞系及組織中的表達豐度較高,并且circFLI1 E2-4及circFLI1 E2-5的表達水平與小細胞肺癌的淋巴結轉移情況呈正相關。2.Circ FLI1 E2-4在小細胞肺癌患者血清中的表達豐度較健康人群明顯升高,且可在化療后疾病緩解情況下表達豐度明顯降低,有望成為小細胞肺癌患者治療的生物學標志物。3.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5對小細胞肺癌細胞的增殖、凋亡、細胞周期及克隆形成能力無明顯影響,而小細胞肺癌細胞的轉移能力有明顯影響,敲低上述兩種circFLI1可明顯抑制小細胞肺癌細胞的轉移能力。4.敲低circFLI1 E2-4可明顯增強小細胞肺癌細胞對化療藥物依托泊苷(VP-16)的敏感性,而敲低circFLI1 E2-5則無上述效應。5.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5可與miR-584-3p結合。6.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5并進一步影響miR-584-3p下游ROCK蛋白的表達,從而間接調(diào)控Rho A/ROCK信號通路,導致小細胞肺癌細胞轉移的發(fā)生。研究結論:本項目通過于組織水平、細胞水平和分子水平上完成了對circFLI1功能及作用機制的研究,揭示了circFLI1在小細胞肺癌轉移及藥物耐藥方面所發(fā)揮的功能。并進一步探討了circFLI1參與調(diào)控的信號通路,闡明了circFLI1通過直接與miR-584-3p的相互作用抑制其活性,調(diào)控miR-584-3p下游靶基因的轉錄,進而參與調(diào)控Rho A/ROCK1信號通路。本研究揭示了新的小細胞肺癌轉移及藥物耐藥新的分子機制,并為Rho A/ROCK1信號通路的完整研究提供了有力的新線索。
[Abstract]:In recent 40 years , it has been shown that FLI1 can play an important role in the treatment of small cell lung cancer . The expression of FLI1 in small cell lung cancer cells and tissues of small cell lung cancer has been investigated by means of real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and fluorescence in situ hybridization ( FISH ) . FISH媯，

本文編號：1799065