發(fā)布時間：2018-04-25 01:07

  本文選題：FLI1環(huán)狀RNA + 小細(xì)胞肺癌��； 參考：《吉林大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤,在我國肺癌已成為發(fā)病率及死亡率排名第一的惡性腫瘤,其中小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)在肺癌中所占的比例約為15%。小細(xì)胞肺癌具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)性及生長迅速的生物學(xué)特點(diǎn),大多數(shù)小細(xì)胞肺癌診斷時已為廣泛期,局限期僅占1/3,局限期和廣泛期小細(xì)胞肺癌5年生存率僅為10%和2%。近40年來,小細(xì)胞肺癌的治療并未取得明顯的進(jìn)展,目前鉑類聯(lián)合依托泊苷的化療方案仍是小細(xì)胞肺癌的一線治療選擇,大多數(shù)患者在治療后1年內(nèi)復(fù)發(fā)或進(jìn)展,這些患者進(jìn)一步治療后的中位生存時間只有4-5個月。如何提高小細(xì)胞肺癌治療效果是人類健康研究亟待解決的重要研究課題。主要由于小細(xì)胞肺癌分子機(jī)制的研究尚不清晰。因此明確小細(xì)胞肺癌疾病發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制是目前小細(xì)胞肺癌研究的重點(diǎn)。我們從癌基因異常表達(dá)分析入手,明確小細(xì)胞肺癌的分子病理機(jī)制,以探索更加合適的靶點(diǎn),將可能為小細(xì)胞肺癌的治療帶來突破性進(jìn)展。研究背景:弗里德白血病病毒插入位點(diǎn)1(Friend leukemia virus integration 1,FLI1)屬于Ets(E26 transformation-specific)家族的轉(zhuǎn)錄因子,最早由Ben-David等在Friend病毒誘導(dǎo)的小鼠紅白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。通常情況下,FLI1主要存在于造血系統(tǒng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞及纖維母細(xì)胞中,此后通過研究證實FLI1可在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮始動基因的作用。促癌基因FLI1可以通過特異性序列結(jié)合多種基因的啟動子或增強(qiáng)子從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活性,例如Bcl-2,而發(fā)揮促癌作用。近年來,隨著對FLI1研究的深入,越來越多的研究顯示FLI1在尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma,EWS)、惡性黑色素瘤(metastatic melanomas)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)、轉(zhuǎn)移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)、子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)等多種實體腫瘤中亦存在異常高表達(dá),且與上述腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前我們研究團(tuán)隊已證實FLI1在小細(xì)胞肺癌組織中異常高表達(dá),且與小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡及克隆形成能力等惡性表型密切相關(guān)。近年來,隨著RNA二代測序的進(jìn)展,circRNA這一特殊的非編碼RNA分子受到越來越多研究者們的關(guān)注。與線性RNA不同,circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu),不受RNA外切酶影響,表達(dá)穩(wěn)定且不易降解。最近研究報道circRNA分子富含miRNA結(jié)合位點(diǎn),在細(xì)胞中起到miRNA海綿的作用,能阻斷或降低miRNA對基因的抑制作用,從而調(diào)控靶基因的表達(dá);同時還具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的潛能。我們通過前期數(shù)據(jù)庫調(diào)研發(fā)現(xiàn)FLI1基因存在6種circRNAs形式,進(jìn)一步通過對不同種肺癌細(xì)胞系及肺癌組織的檢測發(fā)現(xiàn)有兩種FLI1環(huán)狀RNA(circFLI1)形式,即由FLI1外顯子234形成的circRNA(circFLI1 E2-4)及由FLI1外顯子2345形成的circRNA(circFLI1 E2-5),在小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)豐度顯著高于非小細(xì)胞肺癌,但其在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中是否存在一定功能及其具體作用機(jī)制如何仍需進(jìn)一步研究證實。研究目的:1.檢測circFLI1在不同肺癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)豐度。2.分析circFLI1與小細(xì)胞肺癌臨床特征的相關(guān)性。3.全面評估circFLI1在小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的生物學(xué)功能。4.探討circFLI1促癌的分子機(jī)制,揭示circFLI1參與調(diào)控的信號通路以及下游靶基因。研究方法:通過實時定量熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-PCR)及熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)檢測的方法檢測circFLI1在不同肺癌細(xì)胞及組織中的表達(dá)豐度,特別是在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況,統(tǒng)計學(xué)方法分析circFLI1與小細(xì)胞肺癌臨床特征的相關(guān)性。通過sh RNA穩(wěn)定干涉circFLI1的表達(dá),并應(yīng)用MTT、細(xì)胞計數(shù)法、流式細(xì)胞儀、Annexin V/7-AAD染色、Transwell和平板克隆形成實驗評估circFLI1對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移及克隆形成能力的影響。并通過裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型對circFLI1s在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)實驗驗證。應(yīng)用熒光素酶活性測試、western blot、RT-PCR、FISH檢測及用逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)捕獲法(reverse transcription associated trap assay,RAT)等方法對分子機(jī)制進(jìn)行探討。研究結(jié)果:1.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系及組織中的表達(dá)豐度較高,并且circFLI1 E2-4及circFLI1 E2-5的表達(dá)水平與小細(xì)胞肺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)。2.Circ FLI1 E2-4在小細(xì)胞肺癌患者血清中的表達(dá)豐度較健康人群明顯升高,且可在化療后疾病緩解情況下表達(dá)豐度明顯降低,有望成為小細(xì)胞肺癌患者治療的生物學(xué)標(biāo)志物。3.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期及克隆形成能力無明顯影響,而小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力有明顯影響,敲低上述兩種circFLI1可明顯抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。4.敲低circFLI1 E2-4可明顯增強(qiáng)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對化療藥物依托泊苷(VP-16)的敏感性,而敲低circFLI1 E2-5則無上述效應(yīng)。5.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5可與miR-584-3p結(jié)合。6.Circ FLI1 E2-4及circFLI1 E2-5并進(jìn)一步影響miR-584-3p下游ROCK蛋白的表達(dá),從而間接調(diào)控Rho A/ROCK信號通路,導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生。研究結(jié)論:本項目通過于組織水平、細(xì)胞水平和分子水平上完成了對circFLI1功能及作用機(jī)制的研究,揭示了circFLI1在小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及藥物耐藥方面所發(fā)揮的功能。并進(jìn)一步探討了circFLI1參與調(diào)控的信號通路,闡明了circFLI1通過直接與miR-584-3p的相互作用抑制其活性,調(diào)控miR-584-3p下游靶基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而參與調(diào)控Rho A/ROCK1信號通路。本研究揭示了新的小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移及藥物耐藥新的分子機(jī)制,并為Rho A/ROCK1信號通路的完整研究提供了有力的新線索。
[Abstract]:In recent 40 years , it has been shown that FLI1 can play an important role in the treatment of small cell lung cancer . The expression of FLI1 in small cell lung cancer cells and tissues of small cell lung cancer has been investigated by means of real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and fluorescence in situ hybridization ( FISH ) . FISH媯，

本文編號：1799065