本文選題：乳腺癌 + genistein　； 參考：《鄭州大學》2016年博士論文

【摘要】：乳腺癌是最常見的威脅女性的癌癥之一,并且它的全球發(fā)生率還在不斷增加。重要的是,乳腺癌是女性癌性相關死亡中第二大死亡原因,在美國約占所有女性癌癥相關死亡的15%。有效治療和預防這種病態(tài)的疾病仍然是個重大的挑戰(zhàn)。運用天然化合物對乳腺癌的預防和治療仍然是乳腺癌研究的主要工作之一。CIP2A是蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A),是在2007年最新發(fā)現(xiàn)的致癌基因。CIP2A能夠抑制PP2A,通過活化AKT并抑制PP2A誘導的對癌性蛋白c-Myc的去磷酸化作用,從而穩(wěn)定c-Myc蛋白的水平,并參與促進癌細胞的增殖、轉化和細胞周期的調(diào)控過程,抑制放化療所誘導的癌細胞凋亡的發(fā)生。CIP2A在人的多種良性組織樣本中是呈現(xiàn)低表達的,而在乳腺癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤組織中卻呈現(xiàn)高表達。研究表明CIP2A與臨床病理參數(shù)和預后有一定關系。那么CIP2A能否成為乳腺癌的潛在治療靶點以及其與抗乳腺癌藥物之間的相互調(diào)節(jié)與作用機制等方面還有待進一步研究。Genistein(染料木素)是大豆異黃酮的主要成分之一,是一種天然的化合物,其活性強,具有植物雌激素和酪氨酸激酶抑制劑的特性。已有研究證明,高攝入量的大豆與降低乳腺癌風險率相關聯(lián)。盡管genistein介導的抗腫瘤研究取得了一些進展,但其作用機理仍不十分清楚。本實驗中,我們研究了genistein在用于抗乳腺癌治療時對CIP2A的調(diào)節(jié)作用。首先,通過MTT和western blot的結果提示CIP2A對genistein誘導的生長抑制和凋亡有功能性的影響,進一步證實了genistein可以誘導CIP2A在乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D中表達下調(diào),并與genistein誘導的乳腺癌細胞生長抑和凋亡活動有關。我們研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌細胞中CIP2A過表達可以減弱genistein誘導的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡活動;反之,當CIP2A的表達沉默后,則增加其對genistein誘導的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡的敏感性。我們進一步驗證了genistein誘導的CIP2A下調(diào)機制既包含了轉錄水平抑制又包含了蛋白酶體降解過程。特別的是,高濃度的genistein可以一并誘導E2F1和CIP2A的下調(diào)。且高表達的E2F1減弱了genistein誘導的CIP2A在m RNA水平的下調(diào),這表明E2F1從轉錄水平上抑制了genistein誘導的CIP2A下調(diào)。綜上所述,在這部分實驗中證實了CIP2A可以作為genistein的功能作用靶點,且E2F1介導的CIP2A轉錄水平的調(diào)節(jié)導致了CIP2A在蛋白水平的下調(diào)。我們的實驗數(shù)據(jù)提高了對genistein誘導的生長抑制和凋亡活動的理解,提示CIP2A在乳腺癌抗癌相關試劑研究方面可以作為一個藥物作用靶點。ErbB2為表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)家族成員之一,約1/3左右的乳腺癌患者被檢測到體內(nèi)癌細胞中ErbB2基因的過量表達。Lapatinib(拉帕替尼)是ErbB2和EGFR的小分子抑制劑,已被用于ErbB2過度表達的乳腺癌治療,然而lapatinib的耐藥性已成為臨床應用難題。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)沉默乳腺癌耐藥細胞(lapatinib resistent,LR)BT474/LR中的CIP2A之后,對lapatinib所誘導的生長抑制和凋亡的敏感性增加。表明CIP2A是lapatinib的一個關鍵性抑制因子,有助于臨床上對lapatinib所誘導的抗腫瘤活性和耐藥性的研究,以進一步證明CIP2A調(diào)節(jié)可以作為抗乳腺癌試劑方面研究的一個有效藥物作用靶點。第一部分Genistein作用乳腺癌細胞后CIP2A表達變化目的檢測genistein作用于乳腺癌細胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D后CIP2A的蛋白水平表達,以及genistein對乳腺癌細胞的生長抑制和凋亡活動的影響。方法1.選用實驗室構建的Caspase3穩(wěn)定表達的MCF-7/Caspase3(MCF-7-C3)細胞株,Western blot檢測經(jīng)不同濃度genistein處理后乳腺癌細胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D中的CIP2A、PARP/cleaved PARP、caspase-3、cleaved caspase-3的表達水平變化。2.采用MTT比色分析法檢測不同濃度genistein(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM,60μM)對乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D增殖的影響。3.用流式細胞儀分析genistein處理乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D前后對細胞周期分布的影響。結果1.Genistein對乳腺癌細胞MCF-7、MCF-7-C3和T47D中的CIP2A蛋白表達有下調(diào)的作用,且隨著genistein濃度的升高,對CIP2A蛋白的下調(diào)作用增強;通過western blot檢測凋亡蛋白表達水平顯示,genistein可以引起明顯的凋亡活動,減少總caspase-3蛋白水平的表達,增加caspase-3和PARP的切割帶產(chǎn)生。提示genistein誘導的CIP2A下調(diào)與總caspase-3水平的下降、caspase-3和PARP的切割帶升高有關,即genistein介導的CIP2A蛋白水平的下調(diào)與其誘導的乳腺癌細胞凋亡活動有關。2.MTT結果顯示,genisten(?10μM)對乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D有生長抑制作用,且呈濃度依賴性。3.流式細胞儀分析細胞周期分布顯示,與各對應細胞株的對照組相比,genistein可以使乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D在G0/G1期發(fā)生阻滯。結論Genistein可以下調(diào)癌基因CIP2A的蛋白表達,其介導的CIP2A下調(diào)活動可能與genistein誘導的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡活動發(fā)生有關。第二部分CIP2A過表達減弱乳腺癌細胞對genistein的敏感性目的為了研究CIP2A過表達是否減弱乳腺癌細胞對genistein的藥物敏感性,即CIP2A過表達減弱genistein誘導的乳腺癌細胞生長抑制活動和凋亡的發(fā)生。方法1.用CIP2A過表達編碼的慢病毒分別感染乳腺癌細胞株MCF-7-C3和T47D,對照組感染空載質(zhì)粒。經(jīng)篩選后獲得穩(wěn)定混合克隆細胞株,經(jīng)Western blot檢測,對各個穩(wěn)定克隆細胞株CIP2A蛋白的表達情況進行鑒定。2.MTT檢測genistein對穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各對照組細胞增殖的影響。3.流式細胞儀檢測genistein對穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各對照組細胞的細胞周期分布的影響。4.ELISA檢測genistein對穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各對照組細胞的凋亡影響。5.Western blot檢測genistein對穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/CIP2A、T47D/CIP2A和各對照組細胞CIP2A蛋白水平表達和凋亡蛋白PARP的影響。結果1.經(jīng)過篩選和Western blot鑒定,獲得穩(wěn)定CIP2A過表達的乳腺癌細胞株MCF-7-C3和T47D,分別命名為MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A細胞。2.MTT細胞增殖實驗結果顯示,穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A經(jīng)過genistein不同濃度(0μM,5μM,10μM,20μM,40μM,60μM)處理5天后,與各自的對照組細胞相比,genistein對CIP2A過表達乳腺癌細胞MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A的生長抑制作用明顯減弱。3.流式細胞儀分析細胞周期分布結果顯示,在CIP2A過表達細胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A中,與對照組細胞相比,CIP2A過表達減緩了genistein誘導的乳腺癌細胞在G0/G1期的阻滯情況。4.ELISA凋亡分析數(shù)據(jù)顯示,與各自對照組相比,CIP2A過表達減緩了genistein誘導的乳腺癌細胞凋亡的發(fā)生。5.Western blot檢測各組細胞的CIP2A蛋白和凋亡蛋白水平表達變化結果顯示,與相應的對照組相比,genistein對CIP2A過表達細胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A中的CIP2A蛋白水平的下調(diào)作用減弱,即genistein對CIP2A過表達的細胞株MCF-7-C3/CIP2A和T47D/CIP2A的敏感性降低;相應地,genistein對它們的凋亡蛋白PARP切割帶的產(chǎn)生也隨之減少,提示genistein誘導CIP2A過表達的乳腺癌細胞株的凋亡活動減弱。結論CIP2A過表達減弱genistein介導的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡活動的發(fā)生。第三部分CIP2A沉默促進乳腺癌細胞對genistein的敏感性目的為了研究CIP2A沉默是否增加genistein的藥物敏感性,即CIP2A沉默增強genistein誘導的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡的發(fā)生。方法1.實驗中采用CIP2Ash RNA編碼的慢病毒感染MCF-7-C3和T47D細胞,對照組感染空載質(zhì)粒。Western blot檢測篩選后的穩(wěn)定克隆細胞株在CIP2A蛋白水平的表達。2.MTT細胞增殖實驗結果顯示,穩(wěn)定克隆細胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A經(jīng)過genistein不同濃度處理5天后,與各自對應的對照組相比,genistein對MCF-7-C3/si CIP2A、T47D/si CIP2A乳腺癌細胞的生長抑制作用增加。3.流式細胞儀分析細胞周期分布情況顯示,在MCF-7-C3/si CIP2A、T47D/si CIP2A細胞株中,與對照組相比genistein增加了CIP2A沉默的乳腺癌細胞MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A在G0/G1期的阻滯情況。4.ELISA分析細胞凋亡數(shù)據(jù)顯示,與各自相應的對照組相比,genistein增加了CIP2A沉默的乳腺癌細胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A細胞凋亡的發(fā)生。5.Western blot檢測各組細胞的CIP2A蛋白和凋亡蛋白水平表達變化結果顯示,與相應的對照組相比,genistein對CIP2A沉默細胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A中的CIP2A蛋白水平的下調(diào)作用增加,即genistein對CIP2A沉默細胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A的敏感性增強;genistein促進了CIP2A沉默細胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A中的PARP的切割帶的產(chǎn)生,提示genistein介導的CIP2A沉默的乳腺癌細胞的凋亡活動加強。結果1.經(jīng)過puromycin篩選和Western blot鑒定,獲得穩(wěn)定CIP2A沉默細胞株MCF-7-C3和T47D,分別命名為MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A。2.MTT比色分析結果顯示,穩(wěn)定克隆細胞MCF-7-C3/si CIP2A、T47D/si CIP2A經(jīng)genistein處理5天后,與對應的對照組相比,genistein促進了CIP2A沉默細胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A的生長抑制。3.流式細胞儀分析細胞周期分布情況顯示,在CIP2A沉默細胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A中,genistein增加了乳腺癌細胞G0/G1期的阻滯。4.ELISA分析細胞凋亡數(shù)據(jù)顯示,與相應的對照組相比,genistein促進了CIP2A沉默細胞株MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A的凋亡發(fā)生。5.Western blot結果顯示,與相應的對照組相比,genistein促進了乳腺癌細胞MCF-7-C3/si CIP2A和T47D/si CIP2A中CIP2A蛋白水平的下調(diào),且PARP的切割帶也隨之增加。即genistein對CIP2A沉默的乳腺癌細胞株敏感性增加。結論CIP2A沉默的乳腺癌細胞增加了genistein介導的乳腺癌細胞生長抑制和凋亡活動的發(fā)生。第四部分Genistein誘導CIP2A下調(diào)的分子機制目的從轉錄水平和蛋白酶體通路水平探討genistein下調(diào)CIP2A的作用機制。方法1.Genistein處理乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D后,采用實時熒光定量PCR技術分析genistein對乳腺癌細胞的CIP2A m RNA水平的調(diào)節(jié)。2.Genistein處理乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D細胞后,合并或不合并蛋白酶體抑制劑MG132繼續(xù)培養(yǎng)24h,然后采用Western blot分析對CIP2A蛋白表達水平的影響。3.由于CIP2A蛋白的穩(wěn)定性受到Akt活性的調(diào)節(jié),我們在實驗中用genistein處理乳腺癌細胞后,采用Western blot檢測乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D在p-Akt的蛋白水平變化;E2F1是調(diào)控CIP2A轉錄水平變化的一個重要轉錄因子,在實驗中我們用genistein處理乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D后,用Western blot檢測了E2F1的蛋白表達水平變化,旨在研究E2F1在genistein介導的CIP2A轉錄調(diào)節(jié)中的作用。4.擴增、收取重組E2F1腺病毒,用重組腺病毒E2F1感染MCF-7-C3和T47D細胞后,再用genistein處理各組乳腺癌細胞,經(jīng)Western blot檢測感染腺病毒E2F1后,genistein對乳腺癌細胞中E2F1、CIP2A和c-Myc的蛋白水平調(diào)節(jié)。5.采用腺病毒E2F1感染MCF-7-C3和T47D細胞,我們將不同的E2F1表達水平的乳腺癌細胞經(jīng)genistein處理后,檢測乳腺癌細胞CIP2A在m RNA水平表達變化。結果1.實時熒光定量PCR檢測結果顯示,在乳腺癌細胞MCF-7-C3和T47D中用25μM或50μM genistein處理過后的CIP2A的m RNA水平明顯下降;且在低濃度的genistein處理后的乳腺癌細胞中CIP2A的m RNA水平有了輕度的升高。這種劑量依賴式模式變化與我們前面研究的genistein對CIP2A在蛋白水平變化相一致。2.Western blot結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過用蛋白酶抑制劑MG132處理后的細胞可以明顯逆轉genistein所誘導的CIP2A在蛋白水平的下調(diào)。3.Western blot顯示在genistein處理后的乳腺癌細胞中Akt的活性受到抑制;轉錄因子E2F1也隨著CIP2A在蛋白水平的下調(diào)而也呈劑量依賴式下調(diào)。4.Western blot分析顯示,乳腺癌細胞中E2F1過表達可以減弱genistein誘導的CIP2A蛋白水平的下調(diào)和c-Myc蛋白下調(diào)的表達。5.實時熒光定量PCR分析提示,乳腺癌細胞中E2F1過表達可以引起CIP2A在m RNA水平顯著升高,經(jīng)genistein處理之后又隨之下降。提示E2F1在這兩種乳腺癌細胞系中的過表達可以減弱genistein誘導的CIP2A在m RNA水平的下調(diào)。結論Genistein誘導的CIP2A轉錄水平的抑制與CIP2A的蛋白水平下調(diào)有關且受到蛋白酶體通路的調(diào)節(jié);genistein誘導的CIP2A在蛋白水平發(fā)生的下調(diào)導致乳腺癌細胞中Akt的活性受到抑制;轉錄因子E2F1在genistein誘導的CIP2A m RNA水平下調(diào)中起關鍵作用,這一變化導致了整個CIP2A在蛋白水平的下調(diào)。第五部分CIP2A調(diào)節(jié)在lapatinib耐藥細胞中的作用目的檢測CIP2A沉默后BT474/LR細胞對lapatinib的敏感性變化,探討CIP2A在lapatinib耐藥性(LR)乳腺癌細胞中的作用,方法1.采用本實驗室已建好的lapatinib耐藥細胞株BT474/LR,用MTT比色分析驗證BT474和BT474/LR乳腺癌細胞對lapatinib的不同敏感性。2.分析lapatinib對乳腺癌細胞BT474和BT474/LR中CIP2A蛋白表達水平的影響。3.以CIP2Ash RNA編碼的慢病毒感染BT47/LR細胞,篩選和建立有效CIP2A沉默的穩(wěn)定克隆細胞株BT474/LR/si CIP2A。4.以MTT比色分析檢測BT474/LR中CIP2A沉默對lapatinib敏感性作用。5.ELISA分析lapatinib對BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A細胞凋亡的影響。6.Lapatinib處理BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A細胞后,Western blot分析各組細胞在CIP2A、PARP、caspase-3和cleaved caspase-3(c-caspase-3)蛋白水平的表達。7.Lapatinib處理BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A細胞后,Westernblot分析lapatinib對各組細胞CIP2A、p-Akt和Akt蛋白水平的影響。結果1.用lapatinib處理乳腺癌細胞BT474和BT474/LR后,MTT比色分析結果顯示BT474/LR細胞對抗lapatinib誘導的生長抑制。2.Western blot結果顯示,BT474和BT474/LR細胞經(jīng)lapatinib處理后,BT474/LR細胞對抗lapatinib誘導CIP2A下調(diào)。3.Western blot檢測CIP2Ash RNA編碼的慢病毒感染BT474/LR后的穩(wěn)定克隆細胞株在CIP2A蛋白水平上的表達,CIP2A表達得到有效沉默。4.MTT結果提示,相對于BT474/LR中l(wèi)apatinib所誘導的近乎忽略的增長抑制,CIP2A在BT474/LR細胞中沉默后,顯著增強這些細胞對lapatinib的敏感性。5.ELISA分析lapatinib對BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A細胞凋亡的結果提示,lapatinib對BT474/LR細胞的凋亡幾乎沒有影響;而CIP2A在BT474/LR細胞中沉默后,lapatinib對其凋亡作用明顯增強。提示CIP2A沉默后,增強了BT474/LR對lapatinib誘導的凋亡活動。6.Lapatinib處理BT474/LR和BT474/LR/si CIP2A細胞后,Western blot分析結果顯示,CIP2A在BT474/LR細胞中沉默后,lapatinib誘導的PARP和caspase-3的cleavage剪切片段都協(xié)同增加。7.CIP2A沉默后BT474/LR對lapatinib引起的p-Akt的抑制作用增強。提示CIP2A沉默后BT474/LR對lapatinib誘導的BT474/LR細胞的生長抑制和凋亡可能與其引起的p-Akt的抑制作用相關。結論CIP2A沉默增強BT474/LR細胞株對lapatinib的敏感性,也增加lapatinib誘導的生長抑制和凋亡活動,其誘導機制可能與CIP2A沉默后增加lapatinib對BT474/LR細胞中Akt活性的抑制相關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 李晶;李忠;莫寶慶;;ERK5MAPK在genistein對MDA-MB-231細胞增殖抑制中的作用[J];衛(wèi)生研究;2006年02期

，

本文編號：1795728