發(fā)布時(shí)間：2018-04-24 07:03

  本文選題：骨肉瘤 + KLF轉(zhuǎn)錄因子　； 參考：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：骨肉瘤(osteosarcoma,os)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤,多發(fā)生于兒童和青少年發(fā)育時(shí)期。通過手術(shù)治療后,發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤病人的術(shù)后五年存活率普遍低于20%。骨肉瘤如果不及時(shí)治療,往往會(huì)在6至12個(gè)月內(nèi)通過血行轉(zhuǎn)移的方式發(fā)生肺轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,這已經(jīng)成為骨肉瘤臨床觀察中,最為顯著的特征之一,也是影響病人預(yù)后的主要因素。KLF8(Krüppel-like factor 8)是KLF轉(zhuǎn)錄因子家族第一亞群的一員。KLF家族在N末端均具有三個(gè)高度保守的鋅指蛋白結(jié)構(gòu),可以特異結(jié)合富含GC的啟動(dòng)子區(qū)。KLF轉(zhuǎn)錄因子在人類生長發(fā)育以及各種疾病包括腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。KLF8被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。KLF8是調(diào)控細(xì)胞周期的重要轉(zhuǎn)錄因子,其在致癌性轉(zhuǎn)化(oncogenic transformation)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)中具有關(guān)鍵作用。雖然關(guān)于KLF8在腫瘤中的功能已有不少的研究,但KLF8在人骨肉瘤中的功能還未見詳盡報(bào)道。本研究的目的就是探討KLF8在Saos-2骨肉瘤細(xì)胞中尤其是細(xì)胞侵襲中的生物學(xué)作用。首先通過RT-PCR(real-time PCR)和western blotting實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)KLF8在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常成骨細(xì)胞中的表達(dá),且惡性越高、侵襲性越強(qiáng)的細(xì)胞,KLF8的表達(dá)量越高。同時(shí)對骨肉瘤病理組織的檢測發(fā)現(xiàn),骨肉瘤原發(fā)灶KLF8表達(dá)高于癌旁組織,但低于肺轉(zhuǎn)移灶。通過構(gòu)建沉默KLF8基因表達(dá)的sh RNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染入Saos-2細(xì)胞,以隨機(jī)合成的sh RNA作為陰性對照,QRT-PCR及WB檢測發(fā)現(xiàn)在高惡性骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2細(xì)胞中成功沉默了KLF8基因的表達(dá),顯著下調(diào)了KLF8的m RNA和蛋白水平。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)KLF8-sh RNA的Saos-2細(xì)胞,分析了KLF8基因的沉默對骨肉瘤細(xì)胞系生長增殖的影響。首先用MTT方法測定細(xì)胞增殖情況。同陰性對照細(xì)胞相比,sh RNA-KLF8組的細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對照細(xì)胞,說明KLF8的沉默抑制了細(xì)胞的增殖。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KLF8表達(dá)降低的細(xì)胞形成克隆數(shù)明顯少于對照細(xì)胞,說明KLF8影響了細(xì)胞的群體依賴性和克隆形成能力。流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)KLF8的沉默使骨肉瘤細(xì)胞在G0/G1期停滯,且細(xì)胞凋亡率顯著提高。說明KLF8對細(xì)胞增殖的影響是通過使細(xì)胞周期停滯和增加細(xì)胞凋亡兩方面來完成的。通過Transwell@細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測KLF8沉默后細(xì)胞侵襲能力的變化,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KLF8的沉默降低了細(xì)胞分解細(xì)胞基質(zhì)并侵襲到下層小室的能力。跟陰性對照比,遷移到下層小室的細(xì)胞明顯少于對照細(xì)胞,說明KLF8的RNA干擾影響了骨肉瘤細(xì)胞的侵襲能力。本研究顯示KLF8在骨肉瘤的發(fā)生以及細(xì)胞的侵襲性中具有重要的調(diào)控作用,并為KLF8在骨肉瘤治療中作為可能的藥物治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:Osteosarcomaosarcoma is the most common primary malignant bone tumor occurring in children and adolescents. After surgical treatment, the 5-year survival rate of metastatic osteosarcoma patients was generally lower than 20%. If osteosarcoma is not treated in time, pulmonary metastasis often occurs within 6 to 12 months through blood metastasis, which has become one of the most prominent features in clinical observation of osteosarcoma. KLF8 Kr 眉 ppel-like factor 8 is a member of the first subgroup of KLF transcription factor family. KLF family has three highly conserved zinc finger protein structures at the N-terminal. KLF transcription factor plays an important regulatory role in human growth and development and various diseases, including tumorigenesis. KLF8 has been found to be regulated by overexpression of .KLF8 in various tumor cells. An important transcription factor in cell cycle, It plays a key role in carcinogenic transformation and epithelial-mesenchymal transformation (EMT). Although there have been many studies on the function of KLF8 in human osteosarcoma, the function of KLF8 in human osteosarcoma has not been reported in detail. The purpose of this study was to investigate the biological role of KLF8 in Saos-2 osteosarcoma cells, especially in cell invasion. The expression of KLF8 in osteosarcoma cell line was much higher than that in normal osteoblast cell line, and the higher the malignancy, the higher the expression of KLF8 in the osteosarcoma cell line. The expression of KLF8 in primary tumor was higher than that in paracancerous tissue, but lower than that in lung metastasis. The sh RNA lentivirus vector which silenced the expression of KLF8 gene was constructed and transfected into Saos-2 cells. The expression of KLF8 gene was successfully silenced in high malignant osteosarcoma cell line Saos-2 by RT-PCR and WB detection using the randomly synthesized sh RNA as negative control. The m RNA and protein levels of KLF8 were significantly down-regulated. Saos-2 cells stably expressing KLF8-sh RNA were constructed, and the effects of KLF8 gene silencing on the growth and proliferation of osteosarcoma cell lines were analyzed. Cell proliferation was measured by MTT method. Compared with the negative control cells, the number of cells in the RNA-KLF8 group was significantly lower than that in the negative control cells, indicating that the silencing of KLF8 inhibited the proliferation of the cells. The results of plate clone formation test and soft Agar clone formation test showed that the number of cell forming clones with decreased KLF8 expression was significantly lower than that of the control cells, which indicated that KLF8 affected the colony dependence and clone formation ability of the cells. Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. It was found that the silencing of KLF8 made osteosarcoma cells arrest in G0/G1 phase and the rate of apoptosis increased significantly. The results showed that the effect of KLF8 on cell proliferation was achieved by arrest of cell cycle and increase of apoptosis. Transwell @ cell invasion assay was used to detect the changes of cell invasion ability after KLF8 silencing. It was found that the silencing of KLF8 decreased the ability of cells to break down the cell matrix and invade the lower chamber. Compared with the negative control, the number of cells migrating to the lower chamber was significantly lower than that of the control cells, indicating that the RNA interference of KLF8 affected the invasion ability of osteosarcoma cells. This study shows that KLF8 plays an important role in the pathogenesis of osteosarcoma and the invasion of osteosarcoma, and provides a theoretical basis for KLF8 as a possible drug target in the treatment of osteosarcoma.
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R738.1

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 田杰;徐川;楊敏慧;李祖國;;補(bǔ)體應(yīng)答基因-32過表達(dá)對SW480細(xì)胞骨架的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年07期

2 趙榮志;吳志浩;周清華;;上皮細(xì)胞間質(zhì)化與腫瘤的轉(zhuǎn)移[J];中國肺癌雜志;2011年07期

3 楊帆;姜蕊;韓俊慶;王勝昔;宋偉;;TGF-β1對AGS細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及體外侵襲的影響[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2010年02期

4 童翔;林向進(jìn);;p53基因與骨肉瘤[J];國際骨科學(xué)雜志;2008年06期

5 朱忠勝;張春林;;骨肉瘤干細(xì)胞研究現(xiàn)狀[J];國際骨科學(xué)雜志;2011年05期

6 羅善超;楊英年;劉劍勇;;樹突狀細(xì)胞疫苗與骨肉瘤免疫療法[J];國際骨科學(xué)雜志;2011年06期

7 律娜;夏娟;程斌;;粘著斑激酶與口腔腫瘤的發(fā)生發(fā)展[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年05期

8 楊宜;李傳郡;王泉;樊攀;鄒亮;詹玲;周慧;趙振國;;骨肉瘤中微小RNA的研究進(jìn)展[J];廣東醫(yī)學(xué);2013年06期

9 楊丞;饒翔;丁莉利;王明華;;順鉑誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2013年15期

10 周紅;許文;陳小娥;;瘢痕疙瘩同位素治療方法的臨床研究[J];東南國防醫(yī)藥;2013年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 趙海霞;Ying Li;Yuzhong Wang;Jing Zhang;Xiaoming Ouyang;Renxiu Peng;Jing Yang;;蜈蚣糖肽抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性的研究(英文)[A];第十一屆全國博士生學(xué)術(shù)年會(huì)（生物醫(yī)藥專題）論文集（上冊，大會(huì)報(bào)告）[C];2013年

2 章必成;高建飛;;腫瘤治療的新靶點(diǎn)——M2巨噬細(xì)胞[A];第四屆湖北省抗癌協(xié)會(huì)青年委員會(huì)學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2012年

3 Xuejun Jiang;Zunzhen Zhang;;Sodium arsenite and arsenic trioxide differently affect the oxidative stress,genotoxicity and apoptosis in A549 cells:an implication for the paradoxical mechanism[A];第十一屆全國博士生學(xué)術(shù)年會(huì)（生物醫(yī)藥專題）論文集（下冊，，墻報(bào)P25-P48）[C];2013年

4 姚宇鋒;龔建平;秦建偉;唐金海;;ALDH1和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及其相關(guān)性[A];2013華東胸部腫瘤論壇暨第六屆浙江省胸部腫瘤論壇論文集[C];2013年

5 Jun Zhang;Ji Cao;Rong Dong;Meidan Ying;Qinjie Weng;Jian Ma;Qiaojun He;Bo Yang;;Tumor hypoxia enhances Non-Small Cell Lung Cancer metastasis by selectively promoting macrophage M2 polarization through the activation of ERK signaling[A];抗腫瘤藥物研究新進(jìn)展與腫瘤個(gè)性化藥物治療論壇論文集[C];2013年

6 劉敏霞;周可成;曹毅;;新的肺癌相關(guān)基因MCRS1病理生理功能研究[A];第十六屆中國科協(xié)年會(huì)——分3環(huán)境污染及職業(yè)暴露與人類癌癥學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2014年

7 譚亞軍;侯啟明;張庶民;;腫瘤干細(xì)胞研究的問題和進(jìn)展[A];2012年中國藥學(xué)大會(huì)暨第十二屆中國藥師周論文集[C];2012年

8 王彩蓮;;肺癌抗血管生成的治療機(jī)制及最新進(jìn)展[A];中國腫瘤內(nèi)科進(jìn)展 中國腫瘤醫(yī)師教育（2014）[C];2014年

9 周凱旋;艾軍;單保恩;;腫瘤干細(xì)胞研究:一個(gè)漫長且不尋常的旅程[A];第十四屆中國科協(xié)年會(huì)第17分會(huì)場：環(huán)境危害與健康防護(hù)研討會(huì)論文集[C];2012年

10 陳妮;周力;洪陽;;腫瘤微環(huán)境與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[A];第十七屆西南地區(qū)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議暨2014貴州省消化病及消化內(nèi)鏡學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳慧君;三重復(fù)合物SOS1/EPS8/ABI1的完整性決定卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[D];武漢大學(xué);2010年

2 張帆;RNA干擾β-catenin基因?qū)θ斯侨饬鯩G63細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響和機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2011年

3 趙磊;新型CD20抗體的設(shè)計(jì)及生物學(xué)功能研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

4 馮大鵬;國人骨肉瘤干細(xì)胞鑒定及生物學(xué)特性研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

5 黎瑋;ABL-N對前列腺癌的抑制作用及其機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

6 譚興國;膽囊癌差異表達(dá)基因分析及AXL、Prostasin在膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究[D];中南大學(xué);2011年

7 劉恩伊;CTEN在胃癌侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2011年

8 柒琳;Trop2調(diào)控頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移及化療敏感性的分子機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2011年

9 應(yīng)美丹;維甲酸信號(hào)通路誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及骨肉瘤腫瘤發(fā)生的機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2011年

10 單中杰;eIF4E與膀胱癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系及體內(nèi)外抑制eIF4E表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];鄭州大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 韓佳;急性髓細(xì)胞白血病中KLF4的表達(dá)及臨床意義[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 楊艷麗;[D];陜西師范大學(xué);2011年

3 張丹;重組腺病毒載體介導(dǎo)人骨形成蛋白BMP2-15誘導(dǎo)干細(xì)胞C2C12成骨作用的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

4 殷娟;IL-8促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞遷移的分子機(jī)制及TMP對其的干預(yù)作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

5 艾教育;抑癌基因AZGP1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義和功能的初步研究[D];鄭州大學(xué);2011年

6 劉麗;FAK，P-FAK（Tyr397）和PTEN在胃腺癌中的表達(dá)及臨床意義[D];鄭州大學(xué);2011年

7 王高;淺藍(lán)菌素抑制人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞遷移和侵襲力的體外研究[D];南昌大學(xué);2011年

8 紀(jì)騰;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及其向腫瘤局部歸巢機(jī)制的初步探索[D];華中科技大學(xué);2010年

9 陳崗;IRTKS蛋白的磷酸化修飾及降解的研究[D];華東理工大學(xué);2011年

10 洪權(quán);抗Thy1大鼠模型的基因表達(dá)譜分析[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2011年

本文編號(hào)：1795631